第九講凝膠電泳技術(shù)

（優(yōu)選）第九講凝膠電泳技術(shù)ppt本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第1頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分凝膠電泳(gelelectrophoresis)技術(shù)本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第2頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分核酸分子雜交技術(shù)本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第3頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分蛋白分子雜交技術(shù)本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第4頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分細(xì)胞轉(zhuǎn)化（原核）/轉(zhuǎn)染（真核）本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第5頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分PCR擴(kuò)增本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第6頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分DNA測(cè)序DNA測(cè)序儀本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第7頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分蛋白測(cè)序本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第8頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分文庫(kù)構(gòu)建本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第9頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分酵母雙雜交本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第10頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分RNA干擾(RNAi):轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù)本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第11頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分第一節(jié)凝膠電泳技術(shù)凝膠電泳（Gelelectrophoresis）

是以凝膠為載體，以電流為驅(qū)動(dòng)，用于分離不同大小、形狀、等電點(diǎn)等分子的技術(shù)。凝膠電泳通常用于分析用途。但也可以作為制備技術(shù)，如在使用質(zhì)譜(MS)、PCR、克隆、DNA測(cè)序、免疫印跡等檢測(cè)之前用于提純分子。本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第12頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分一、核酸的凝膠電泳

基本原理

在buffer為PH8.0時(shí)，帶有負(fù)電荷的DNA或RNA核苷酸鏈，依靠無(wú)反應(yīng)活性的穩(wěn)定介質(zhì)（瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠）和緩沖液，在電場(chǎng)中以一定的遷移率從負(fù)極移向正極。根據(jù)核酸分子大小不同、構(gòu)型或形狀的差異，以及所帶電荷的不同，可以通過(guò)電泳將其混合物中的不同成分彼此分開(kāi)。

本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第13頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分電泳槽電泳儀梳子電泳槽制膠板正極電源插孔負(fù)極電源插孔電源線電泳槽本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第14頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第15頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第16頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分

電泳的遷移率取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型

①分子量較小的DNA分子比分子量較大的DNA分子遷移率要快；

②同等分子量的不同構(gòu)型的核酸分子，構(gòu)型緊密的比線性DNA分子要快，線性DNA分子比開(kāi)環(huán)DNA分子要快。

本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第17頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分圖2線性DNA電泳圖本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第18頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分凝膠電泳的分辨力：

與凝膠的類(lèi)型和密度相關(guān)

瓊脂糖凝膠的分辨力在0.2～50Kb之間;聚丙烯酰胺的分辨力在1～1000bp之間本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第19頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分聚丙烯酰胺凝膠電泳圖（高分辨率，1bp差異可區(qū)分）瓊脂糖凝膠電泳圖本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第20頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分（一）瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖是一種從紅色海藻中提取出的線性多糖聚合物。分為常熔點(diǎn)的瓊脂糖和低熔點(diǎn)（LMP）瓊脂糖。本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第21頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分LMP瓊脂糖熔點(diǎn)：62～65℃

熔解后，在37℃可保持液態(tài)數(shù)小時(shí)；在25℃可保持液態(tài)約10min應(yīng)用：直接酶切，回收DNA分子；在65℃下將LMP瓊脂糖凝膠熔化；加入過(guò)量的酚抽提DNA；離心獲得含DNA分子的上清液。本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第22頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分瓊脂糖凝膠電泳圖本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第23頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分瓊脂糖凝膠電泳的參數(shù)：緩沖液：1×

TAE或TBE凝膠的含量：根據(jù)檢測(cè)的DNA大小加DNA樣品：<1μg，指示劑電泳條件：大片斷低電壓長(zhǎng)時(shí)間，小片段高電壓短時(shí)間染色和觀察：溴化乙錠（ethidiumbromide，EB）染色，在300nm波長(zhǎng)的紫外下觀察（凝膠成像儀）。能看到0.05

μg的微量DNADNA的片斷大小與熒光強(qiáng)度成正比

本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第24頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分TAE:電泳大于13kb的片段時(shí)用TAE緩沖液將取得更好的分離效果。TAE的缺點(diǎn)是緩沖容量小，長(zhǎng)時(shí)間電泳（如過(guò)夜）不可選用，除非有循環(huán)裝置使兩極的緩沖液得到交換。

TBE:緩沖能力強(qiáng)，長(zhǎng)時(shí)間電泳時(shí)可選用TBE，并且當(dāng)用于電泳小于1kb的片段時(shí)分離效果更好（常用）。TPE的緩沖能力也較強(qiáng)，但由于磷酸鹽易在乙醇沉淀過(guò)程中析出，所以也不宜在回收DNA片段的電泳中使用。電泳反沖液本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第25頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分SeparationRangeVs.%Agarose本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第26頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分注意：EB（Ethidiumbromide，溴化乙錠）為強(qiáng)致癌物！?。”疚臋n共48頁(yè)；當(dāng)前第27頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分Agarosegelelectrophoresis本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第28頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第29頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第30頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第31頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分凝膠成像儀本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第32頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分

用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA對(duì)DNA片斷大小的估算

本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第33頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分二、瓊脂糖凝膠電泳的的影響因素瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì),其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場(chǎng)中,在中性pH值下帶負(fù)電荷的DNA向陽(yáng)極遷移,其遷移速率由下列多種因素決定:

1、DNA的分子大小:

線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對(duì)數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。

本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第34頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分2、瓊脂糖濃度

一個(gè)給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對(duì)數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%,分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%,DNA片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。

本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第35頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分3、DNA分子的構(gòu)象

當(dāng)DNA分子處于不同構(gòu)象時(shí),它在電場(chǎng)中移動(dòng)距離不僅和分子量有關(guān),還和它本身構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開(kāi)環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)速度是不一樣的,超螺旋DNA移動(dòng)快,而線狀雙鏈DNA移動(dòng)要慢。如在電泳鑒定質(zhì)粒純度時(shí)發(fā)現(xiàn)凝膠上有數(shù)條DNA帶難以確定是質(zhì)粒DNA不同構(gòu)象引起還是因?yàn)楹衅渌鸇NA引起時(shí),可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個(gè)回收,用同一種限制性?xún)?nèi)切酶分別水解,然后電泳,如在凝膠上出現(xiàn)相同的DNA圖譜,則為同一種DNA。

本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第36頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分4、電源電壓

在低電壓時(shí),線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長(zhǎng),片段越大,因場(chǎng)強(qiáng)升高引起的遷移率升高幅度也越大,因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達(dá)到最大,所加電壓不得超過(guò)5v/cm。

本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第37頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分5、嵌入染料的存在

熒光染料溴化乙啶用于檢測(cè)瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會(huì)嵌入到堆積的堿基對(duì)之間并拉長(zhǎng)線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強(qiáng),還會(huì)使線狀DNA遷移率降低15％。

本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第38頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分6、離子強(qiáng)度影響

電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。在沒(méi)有離子存在時(shí)(如誤用蒸餾水配制凝膠),電導(dǎo)率最小，DNA幾乎不移動(dòng)，在高離子強(qiáng)度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液),則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱,嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或DNA變性。

本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第39頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分第二節(jié)分子雜交

一

Southern雜交二

Northern雜交三

菌落原位雜交四

Western雜交本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第40頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分分子雜交

(moleculehybridization)【分子雜交】是指在分子克隆中的一類(lèi)核酸和蛋白質(zhì)分析方法，用已知標(biāo)記的核酸分子或蛋白質(zhì)分子檢測(cè)混合樣品中未知核酸分子或蛋白質(zhì)分子，以及其相對(duì)分子量大小。根據(jù)其檢測(cè)對(duì)象的不同可分為Southern雜交、Northern雜交和Western雜交，及由此演化的斑點(diǎn)雜交和菌落雜交等。

本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第41頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分分子雜交可在DNA與DNA、RNA與RNA或RNA與DNA的二條單鏈之間進(jìn)行，也可能在蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間進(jìn)行。【核酸分子雜交】是指核酸分子(DNA或RNA)在變性以后，在復(fù)性的過(guò)程中兩個(gè)不同來(lái)源的且同源的核酸分子形成雜合雙鏈的過(guò)程。通過(guò)各種方法將核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性標(biāo)記的探針與被固定的分子雜交，經(jīng)顯影后顯示出目的DNA或RNA分子所處的位置。本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第42頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第43頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分探針標(biāo)記方法體內(nèi)(invivo)標(biāo)記是將放射性標(biāo)記的化合物作為代謝底物加到活細(xì)胞培養(yǎng)體系中去，經(jīng)細(xì)胞的合成代謝而使核素?fù)饺氲叫潞铣傻暮怂岱肿又腥?。體外標(biāo)記法分為化學(xué)法和酶法：①化學(xué)法。最常用的是125I標(biāo)記和光敏生物素(photobiotin)標(biāo)記。②酶法也叫酶促標(biāo)記法，將標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記到核苷酸(NTP或dNTP)分子上，然后利用酶促反應(yīng)將標(biāo)記的核苷酸分子摻人到探針?lè)肿又腥ィ驅(qū)⒑塑账岱肿由系臉?biāo)記基因交換到探針?lè)肿由稀?/p>

本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第44頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分(1)缺口平移法：DNaseI是在兩條鏈的不同部位隨機(jī)打開(kāi)缺口，從而使兩條鏈都被核素均勻地標(biāo)記，使得標(biāo)記的DNA具有較高的放射比活性。3種三磷酸脫氧核糖核苷酸如dATP、dTTP、dGTP，一種核素標(biāo)記的核苷酸32P—dCTP，待標(biāo)記DNA片段。在極微量DNA聚合酶的作用下，在雙鏈DNA分子的一條鏈上隨機(jī)切開(kāi)若干個(gè)缺口而不是切斷DNA或?qū)⑵浣到?，然后，大腸桿菌DNA聚合酶I在切口的3’—OH端逐個(gè)加入新的核苷酸，同時(shí)由于該酶具有5，—3’外切酶的活性，它同時(shí)切除5，端游離的核苷酸，3’端核苷酸的加入和5，端核苷酸的切除同時(shí)進(jìn)行導(dǎo)致切口沿著DNA鏈移動(dòng)。本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第45頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分本文檔共48頁(yè)；當(dāng)前第46頁(yè)；編輯于星期二\19點(diǎn)20分(2)隨機(jī)引物標(biāo)記法：隨機(jī)引物(randomprimer)是人工合成的長(zhǎng)度為6個(gè)核苷酸殘基的寡聚核苷酸片段的混合物，它們的順序是根據(jù)計(jì)算機(jī)分析的生物基因組DNA6核苷酸排列的多種可能性而設(shè)