基因工程實(shí)驗(yàn)

基因工程大實(shí)驗(yàn)

E.Coli感受態(tài)細(xì)胞的制備、質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化、提取與酶切鑒定1

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?/p>

1、通過(guò)本實(shí)驗(yàn)了解和掌握氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化受體菌細(xì)胞的原理與技術(shù)；

2、了解質(zhì)粒DNA的特性，掌握堿裂解法從大腸桿菌細(xì)胞中分離、提取質(zhì)粒DNA的方法；

3、掌握限制性內(nèi)切酶的特性、酶解和瓊脂糖凝膠電泳的操作方法；

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)了解大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備、DNA轉(zhuǎn)化、限制性內(nèi)切酶在分子生物學(xué)研究中的意義與作用。

2二、實(shí)驗(yàn)原理

1、感受態(tài)細(xì)胞制備:所謂感受態(tài)是指受體細(xì)胞處于容易吸收外源DNA的一種生理狀態(tài)，可以通過(guò)物理與化學(xué)方法誘導(dǎo)形成，也可以自然形成，在基因工程技術(shù)中通常采用誘導(dǎo)的方法。用于轉(zhuǎn)化的受體菌細(xì)胞一般是限制-修飾系統(tǒng)（Restriction-Modification）缺陷的變異株，以防止對(duì)導(dǎo)入的外源DNA的切割，用符號(hào)R-M-表示。其基本原理是：細(xì)菌處于0℃的CaCl2低滲溶液中，會(huì)膨脹成球形，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，轉(zhuǎn)化混合物中的質(zhì)粒DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物黏附于細(xì)胞表面，經(jīng)過(guò)42℃短時(shí)間的熱激處理，

3促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物，在豐富的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖，在選擇培養(yǎng)基上可獲得所需的轉(zhuǎn)化子。

2、堿裂解法小量制備質(zhì)粒DNA：堿裂解法是基于線性大分子染色體DNA與小分子環(huán)形質(zhì)粒DNA的變性、復(fù)性的差異達(dá)到分離目的的，在pH12.0～12.6的堿性環(huán)境中，線型染色體DNA和環(huán)型質(zhì)粒DNA氫鍵會(huì)發(fā)生斷裂，雙鏈解開(kāi)而變性，但質(zhì)粒DNA由于其閉合環(huán)型結(jié)構(gòu)，氫鍵僅發(fā)生部分?jǐn)嗔?，而且其互補(bǔ)鏈不完全分離；當(dāng)將pH值調(diào)節(jié)到中性并在高鹽濃度下，已分開(kāi)的染色體DNA互補(bǔ)鏈不能復(fù)性而交聯(lián)形成不溶的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)離心，大部分染色體DNA、不穩(wěn)定的大分子RNA和蛋白

4質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去，而部分變性的閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA在中性條件下很快復(fù)性，恢復(fù)到原來(lái)的構(gòu)型，呈可溶性狀態(tài)保存與溶液中，離心后上清中便含有所需要的質(zhì)粒DNA。

3、限制性內(nèi)切酶：又稱為內(nèi)切酶或限制酶，是一類能識(shí)別雙鏈DNA分子特異性核酸序列的DNA水解酶，是體外剪切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物中。根據(jù)限制酶的識(shí)別切割特性，催化條件及是否具有修飾酶活性可分為Ⅰ、Ⅱ、III型三大類，Ⅰ類和III類限制性內(nèi)切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依賴ATP的限制性內(nèi)切酶活性。Ⅰ類限制性內(nèi)切酶結(jié)合于特定識(shí)別位點(diǎn)，但卻隨機(jī)地切割回5轉(zhuǎn)到被結(jié)合處的DNA。Ⅲ類限制性內(nèi)切酶在識(shí)別位點(diǎn)上切割，然后從底物上解離下來(lái)。故Ⅰ類和Ⅲ限制酶在基因工程中基本不用，II類酶在分子克隆中使用廣泛，其基本特點(diǎn)如下：

(1)、專一性地識(shí)別并切割特定的核苷酸序列，如EcoRI識(shí)別與切割序列為5`····GAATTC····3`

3`····CTTAAG····5`

(2)、識(shí)別的核苷酸數(shù)目大多數(shù)為4～6個(gè)，少數(shù)識(shí)別8～13個(gè)；

(3)、識(shí)別序列大多數(shù)為二重對(duì)稱（回文序列），大多數(shù)酶產(chǎn)生的是具有凸出的粘性末端：6(4)、有不同來(lái)源的限制性內(nèi)切酶可以識(shí)別相同的序列，甚至切割的位點(diǎn)也相同，稱為同裂酶或異源同工酶，如HpaII與MspI；有的識(shí)別位點(diǎn)不同，但對(duì)DNA切割后可產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶，如BamHI與BglII。7影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素：

DNA的純度；

DNA的甲基化程度；

酶切消化反應(yīng)的溫度；

DNA的分子結(jié)構(gòu)；

溶液中離子濃度及種類；

緩沖液的pH值。

4、瓊脂糖凝膠電泳:瓊脂糖溶化再凝固后能形成帶具有一定形狀、大小與孔隙度的固體基質(zhì)(密度與瓊脂糖濃度相關(guān))；而生理?xiàng)l件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中磷酸基團(tuán)呈離子化狀態(tài)，因此將核酸分子置于電場(chǎng)中時(shí)，它們會(huì)向正極遷移，由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此他們能以同樣的速度向正極方向遷移。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移率取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)象。分子量較小的DNA分子，比分子量較大的DNA分子，具有較緊密的構(gòu)型，所以其電泳遷移速率也就比同等分子量的松散型的開(kāi)環(huán)DNA分子或線性DNA分子要快。直接用低濃度的EB進(jìn)行染色，可確定DNA在膠中的位置。

8影響瓊脂糖凝膠電泳DNA遷移率的因素：

DNA的分子大?。画傊菨舛?；

DNA構(gòu)象；電場(chǎng)強(qiáng)度；堿基組成與溫度；嵌入染料的存在；電泳緩沖液的組成。三、實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備：1、用品與與儀器：超凈工作臺(tái)、電熱恒溫水浴、分光光度計(jì)、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫振蕩器、移液器、微型離心管等、臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)、旋渦震蕩器、電泳儀、電泳槽、紫外透射儀，凝膠成像儀、冰箱、制冰機(jī)等；

1.5mL與0.5mLEppendorf管、tip頭、燒杯、量筒9鑷子、試管三角瓶、玻璃涂棒、酒精燈、無(wú)菌牙簽、吸水紙，一次性塑料手套等；

E.coliDH5α受體菌(R-M-)，pTRE2hyg質(zhì)粒(AmpR)2、試劑：

LB培養(yǎng)基:蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，瓊脂粉15g/L（固體培養(yǎng)基），用10mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH為7.0，高壓滅菌；氨芐青霉素貯存液：濃度50-100mg／mL；含有抗菌素的LB平板培養(yǎng)基：將配置好的LB固體培養(yǎng)基高壓滅菌后，冷卻到60度左右，加入氨芐青霉素（終濃度為50μg／mL濃度50-100μg／mL）；100.1mol/LCaCl2：稱取1.1g進(jìn)口無(wú)水CaCl2，溶于70mL雙蒸水中，定容到100mL，過(guò)濾后滅菌；

0.1mol/LCaCl215％甘油：100ml0.1mol/LCaCl2溶液內(nèi)含有15ml甘油，高壓滅菌；

溶液I:50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA(pH8.0)，25mmol/LTris-HCl(pH8.0)；

溶液II:0.2mol/LNaOH,1%SDS(現(xiàn)配現(xiàn)用)；

溶液III:乙酸鉀溶液(3M,pH=4.8)(60mL的5mol/LKAc,11.5ml冰醋酸，28.5mLH2O)；

RNaseA：10mg/ml；

TE緩沖液:10mmol/L，Tris-HCl,1mmol/L，EDTA，pH8.0；

115×TBE緩沖液：0.45mol/LTris－硼酸，0.01mol/LEDTA,pH8.0；

10×Loadingbuffer：1%SDS,0.05%溴酚蘭，50％的甘油；

無(wú)水乙醇；

70％乙醇；

標(biāo)準(zhǔn)分子量片段；

核酸內(nèi)切酶EcoRI(TaKaRa)；

EcoRI酶解緩沖液(10×bufferH)；

瓊脂糖；

溴化乙啶（EB）染色液(10mg/ml)。

12四、操作步驟:

(一)感受態(tài)細(xì)胞的制備：

1、從新活化的E.coliDH5α平板上挑取一單菌落，接種于3～5mlLB液體培養(yǎng)中，37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(12h左右)；

2、將該菌懸液以1:100～1:50轉(zhuǎn)接于100mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液開(kāi)始出現(xiàn)混濁后，每隔20～30min測(cè)一次OD600，至OD600為0.3～0.5時(shí)停止培養(yǎng)，并轉(zhuǎn)裝到1.5mL離心管中；

3、培養(yǎng)物于冰上放置20min；

4、0～4℃，4000g離心10min，棄去上清液，加入1mL冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液，小心懸浮細(xì)胞,冰浴20分鐘；13CaCl2純度至關(guān)重要，不同廠家，甚至同一廠家不同批號(hào)的產(chǎn)品均影響感受態(tài)的轉(zhuǎn)化效率

5、0～4℃，

4000g離心10min，倒凈上清培養(yǎng)液，再用1.0mL冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液輕輕懸浮細(xì)胞，冰浴20min；

6、0～4℃，

4000g離心10min，棄去上清液，加入100μL冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液，小心懸浮細(xì)胞，冰上放置片刻后，即制成了感受態(tài)細(xì)胞懸液；

7、制備好的感受態(tài)細(xì)胞懸液可直接用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，如果在4℃放置12～24h，其轉(zhuǎn)化效率可以增高4～6倍；也可加入占總體積15％左右高壓滅菌過(guò)的甘油，混勻后分裝于1.5ml離心管中，置于-70℃條件下，可保存半年至一年。14（二）質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化：

1、每100μL感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入1μL質(zhì)粒DNA,輕輕搖勻，同時(shí)設(shè)置三組對(duì)照：(1)不加質(zhì)粒，(2)不加受體菌，(3)加已知具有轉(zhuǎn)化活性的質(zhì)粒DNA，具體操作按下表進(jìn)行：*陽(yáng)性對(duì)照，用已知具有轉(zhuǎn)化活性的pTRE2hyg質(zhì)粒DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化

152、冰上放置20～30min，然后42℃水浴熱激90～120Sec，迅速冰上冷卻2min；

3、立即向上述Ep管中加入0.8mLLB液體培養(yǎng)基，搖勻后于37℃振蕩培養(yǎng)約15～30min

，使受體菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)及表達(dá)抗性基因；

4、取培養(yǎng)液50μL接種于含抗菌素的LB平板培養(yǎng)基上，用玻璃涂棒涂勻；

5、將培養(yǎng)皿放在37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)30min,待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿，于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜(14-16h)；（三）堿裂解法小量制備質(zhì)粒DNA:161、挑取轉(zhuǎn)化篩選的帶有目的質(zhì)粒的大腸桿菌接種到液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)12～16小時(shí)；

2、將1.5mL菌液加入Ep離心管中，12000g離心30Sec，棄上清液，在吸水紙上扣干；

離心時(shí)間不能太長(zhǎng)，以免影響下一步的菌體懸浮。

3、加入100L預(yù)冷的溶液I，于渦旋振蕩器上振蕩懸浮細(xì)菌細(xì)胞，盡量使細(xì)胞分散；

溶液I中的葡萄糖的作用是增大溶液的粘度，減少提取過(guò)程中的機(jī)械剪切力，防止染色體DNA的斷裂；EDTA的作用是與二價(jià)離子（Ca2＋）結(jié)合，降低DNase對(duì)DNA的降解。

4、加入200L新配制的溶液II,蓋緊管口,快速顛倒離心管,以混勻內(nèi)容物,冰上放置3－5min;

溶液II中的NaOH與SDS可裂解細(xì)胞，使DNA變性以及SDS使蛋白變性并形成交聯(lián)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。17

5、加入150l溶液III,加蓋后顛倒6-7次混勻，冰上放置2～3min；

溶液III為低pH的醋酸鉀緩沖液，中和NaOH，以便使部分變性的閉環(huán)質(zhì)粒復(fù)性，而細(xì)菌染色體DNA不能正確復(fù)性。

6、12000g離心6min，將上清移入另一干凈的Ep管中；

7、加2倍上清體積(約1mL)的無(wú)水乙醇,振蕩混勻，室溫放置2min.8、12000g離心10min，棄上清液，再用70％的乙醇洗滌一次，12000g離心1min，離心管倒置于吸水紙上扣干，然后在中空濃縮系統(tǒng)上干燥質(zhì)粒；

9、加入40L含20g/mLRNaseA的滅菌蒸餾水或TE緩沖液溶解提取物，室溫放置直到質(zhì)粒完全溶解(約8min)，存于－20℃或直接用于酶切。18質(zhì)粒圖譜:19(四)提取質(zhì)粒的酶切鑒定與瓊脂糖凝膠電泳：

1、在0.5mLEp管中依次加入下列溶液于0.5ml離心管中提取質(zhì)粒DNA3.0L10×bufferH1.0lEcoRI2.0U

ddH2O5.8L

10L

1U:1單位酶通常定義為，在建議緩沖液及溫度下，在20L反應(yīng)液中反應(yīng)1h，使1gDNA完全消化所需的酶量.2、輕輕混勻,4000g離心10秒，置于37℃水浴中酶解1.5h。

3、酶解完成后，加入1.2l10×上樣緩沖液(或2l6×上樣緩沖液),混勻.

4、稱取1g瓊脂糖，置于三角瓶中，加入100mL0.5×TBE或1×TAE緩沖液，瓶口倒扣一個(gè)小燒杯，將該三角瓶置于微波爐加熱直至瓊脂糖溶解。205、將梳子放置在制膠槽上，在冷卻至60℃左右的瓊脂糖凝膠液加入一小滴EB，小心混勻，倒到制膠槽上，直到在整個(gè)有機(jī)玻璃板表面形成均勻的膠層，不要產(chǎn)生氣泡（厚度約為3～4mm）；

6、室溫下靜置30min左右，待凝固完全后，輕輕拔出梳子。

7、制好膠后將凝膠連同內(nèi)槽放在含有0.5×TBE或1×TAE緩沖液的電泳槽中使用(注意:電泳槽中的緩