第四講液相色譜

第四講液相色譜第一頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五一.高效液相色譜法簡介起源于20世紀60年代末至70年代初融合了經(jīng)典液相色譜和氣相色譜的優(yōu)點。速度快、效率高、操作自動化適用于蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖類、植物色素、高聚物、染料及藥物等物質(zhì)的分析。第二頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五比較高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法高速高效液相色譜法在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法快數(shù)百倍。高效由于高效液相色譜應用了顆粒極細(幾微米至幾十微米直徑)、規(guī)則、均勻的固定相，傳質(zhì)阻力小，分離效率高。高靈敏度由于現(xiàn)代高效液相色譜儀普遍配有高靈敏度檢測器，使其分析靈敏度比經(jīng)典色譜有較大提高。

第三頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五高效液相色譜=高速液相色譜=高壓液相色譜第四頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五高效液相色譜法與氣相色譜法比較三方面的優(yōu)點氣相色譜法分析對象只限于分析氣體和沸點較低的化合物，它們僅占有機物總數(shù)的30％。占有機物總數(shù)近70％的高沸點、熱穩(wěn)定性差、分子量大的物質(zhì)，主要采用高效液相色譜法進行分離和分析。氣相色譜一般都在較高溫度下進行的，而高效液相色譜法則經(jīng)常可在室溫條件下工作。第五頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五二.高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)

高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)一般可分為4個主要部分：高壓輸液系統(tǒng)，進樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。此外還配有輔助裝置：如梯度淋洗，自動進樣及數(shù)據(jù)處理等。第六頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第七頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第八頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五高效液相色譜儀工作過程首先高壓泵將貯液器中流動相溶劑經(jīng)過進樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當注入欲分離的樣品時，流經(jīng)進樣器的流動相將樣品同時帶入色譜柱進行分離，然后依先后順序進入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。第九頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五1、高壓輸液系統(tǒng)

一般由儲液罐、高壓輸液泵、過濾器、壓力脈動阻尼器等組成。由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細，因此對流動相阻力很大，為使流動相較快流動，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)。它是高效液相色譜儀最重要的部件，第十頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第十一頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第十二頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第十三頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五2、進祥系統(tǒng)隔膜注射進樣器在色譜柱頂端裝一耐壓彈性隔膜，進樣時用微量注射器刺穿隔膜將試樣注入色譜柱。優(yōu)點：裝置簡單、價廉、死體積小，缺點是允許進樣量小，重復性差。第十四頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五高壓進樣閥目前多采用六通閥進樣。進樣量由定量管的體積嚴格控制，進樣準確，重復性好，適于作定量分析，更換不同體積的定量管，可調(diào)整進樣量。第十五頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五3、色譜柱是液相色譜的心臟部件，包括柱管與固定相兩部分。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長5—30cm，內(nèi)徑為4—5mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑3—12mm，制備柱內(nèi)徑較大，可達25mm以上。第十六頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第十七頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第十八頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五保護柱：一般在分離前備有一個前置柱，內(nèi)填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時不再洗脫其中固定相，保證分離柱性能不受影響。第十九頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第二十頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五4、檢測系統(tǒng)包括兩種基本類型的檢測器。

一類是溶質(zhì)性檢測器。它僅對被分離組分的物理或化學特性有響應，屬于這類檢測器的有紫外、熒光、電化學檢測器等。另一類是總體檢測器，它對試樣和洗脫液總的物理或化學性質(zhì)有響應，屬于這類檢測器的有示差折光，電導檢測器等。第二十一頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第二十二頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第二十三頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第二十四頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第二十五頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第二十六頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第二十七頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第二十八頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五（檢出限可達10－12g/cm3－10－13g/cm3），第二十九頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第三十頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第三十一頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第三十二頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第三十三頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第三十四頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第三十五頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第三十六頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第三十七頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五5、附屬系統(tǒng)它包括脫氣、梯度淋洗、恒溫、自動進樣、餾分收集以及數(shù)據(jù)處理等裝置。梯度淋洗，指在分離過程中使流動相的組成隨時間改變而改變。通過連續(xù)改變色譜柱中流動相的極性、離子強度或pH等因素，使被側(cè)組分的相對保留值得以改變，提高分離效率。第三十八頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第三十九頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第四十頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第四十一頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第四十二頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五四.高效液相色譜法的使用技巧1.分離類型的選擇高效液相色譜法的各種方法都各有其自身特點和應用范圍，一種方法不可能是萬能的，它們往往相互補充。應根據(jù)分離分析目的；試樣的性質(zhì)和量多少；現(xiàn)有設備條件等選擇最合適的方法。一般可根據(jù)試樣的相對分子質(zhì)量大小，溶解度及分子結(jié)構(gòu)等進行分離方法初步選擇。第四十三頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五根據(jù)相對分子質(zhì)量選擇相對分子質(zhì)量十分低的樣品，其揮發(fā)性好，適用于氣相色譜，標準液相色譜類型(液—固、液—液、及離子交換色譜)最適合的相對分子質(zhì)量范圍是200-2000。對于相對分子質(zhì)量大于2000的樣品，則用尺寸排阻法為最佳。第四十四頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五根據(jù)溶解度選擇

如果樣品可溶于水并屬于能離解物質(zhì)，以采用離子交換色譜為佳；如樣品可溶于烴類(如苯或異辛烷)，則可采用液—固吸附色譜；如樣品溶解于四氯化碳。則多采用常規(guī)的分配和吸附色譜分離；如樣品既溶于水又溶于異丙醇時，常用水和異丙醇的混合液作液—液分配色譜的流動相，以憎水性化合物作固定相。第四十五頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五根據(jù)分子結(jié)構(gòu)選擇（用紅外光譜法簡單判斷樣品中的官能團，確定采用的方法）酸、堿化合物用離子交換色譜；脂肪族或芳香族用液—液分配色譜、液—固吸附色譜；異構(gòu)體用液—固吸附色譜；同系物不同官能團及強氫鍵的用液—液分配色譜。第四十六頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第四十七頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五2.流動相溶劑的要求溶劑對于待測樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性?；瘜W穩(wěn)定性好。不能選與樣品發(fā)生反應或聚合的溶劑。高純度、低粘度、與檢測器匹配。第四十八頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第四十九頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第五十頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第五十一頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第五十二頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五五、高效液相色譜法的計算1.外標法 該法是應用最廣泛的方法之一，其誤差來源主要是進樣誤差，因此，分析前一定要做面積重復性（即進樣重復性）實驗。第五十三頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五外標法公式：優(yōu)點：1）不需所有峰都流出或被檢測到2）只對所測組分作校正缺點：1）進樣量必須準確2）儀器必須有良好的穩(wěn)定性第五十四頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五2、內(nèi)標法 在樣品中添加內(nèi)標物，通過組分與內(nèi)標峰的面積比，對組分進行定量。該方法減小了進樣誤差對定量結(jié)果的影響。第五十五頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五選擇內(nèi)標物應注意理化性質(zhì)與待測物相近色譜響