早期肌肉特異性mRNA在骨髓干細(xì)胞的表達

早期肌肉特異性mRNA在骨髓干細(xì)胞的表達【摘要】目的：研究早期肌肉特異性mRNA在骨髓干細(xì)胞中的特異性表達.方法：利用RTPCR研究不同時期C57鼠和不同代齡SD大鼠骨髓干細(xì)胞早期肌肉特異性mRNA的表達.結(jié)果：Myf5及desmin在新鮮分離、培養(yǎng)了2d和7d的懸浮與貼壁的C57小鼠骨髓干細(xì)胞中均有表達，沒有檢測到MyoD,myogenin和MRF4在此時期小鼠骨髓干細(xì)胞的表達.MyoD與desmin在原代至第6代SD大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞中均有表達，沒有檢測到myogenin和MRF4在各代細(xì)胞中的表達.結(jié)論：骨髓干細(xì)胞能表達一定水平的早期肌肉特異性mRNA.

【關(guān)鍵詞】骨髓祖代細(xì)胞；組織特異性；肌形成調(diào)節(jié)因子

0引言

在不同的誘導(dǎo)條件下，成體造血干細(xì)胞可分化形成腦的星形膠質(zhì)細(xì)胞，少突膠質(zhì)細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞，肌細(xì)胞和肝細(xì)胞等，骨髓間質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)外也可分化為肝、軟骨、脂肪、骨、腎、肌腱、腦和肌細(xì)胞等［1-2］.目前對骨髓干細(xì)胞可塑性的研究很多，而且對骨髓干細(xì)胞表達抗原的研究普遍集中在對其表面抗原表達的研究方面，而對組織特異性抗原在未分化骨髓干細(xì)胞的表達的研究報道卻較少［3］.我們的研究旨在探討肌肉特異性抗原desmin和成肌調(diào)節(jié)因子在骨髓干細(xì)胞的表達情況.

1材料和方法1材料大鼠骨髓干細(xì)胞和小鼠骨髓干細(xì)胞(mMSC)分別取自SD鼠和C57BL/6J鼠的股骨與脛骨骨髓；正常SD鼠和C57BL/6J鼠購于中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，體質(zhì)量分別為100g和20g，雄性.DMEM，F(xiàn)10干粉培養(yǎng)基，胰蛋白酶粉劑，RTPCR試劑盒，Trizol；胎牛血清(美國Hyclone公司）；DEPC.所選用或設(shè)計的RTPCR引物均至少跨越1個外顯子，這就避免了因DNA污染而產(chǎn)生假陽性的可能性.所有引物均由上海生工合成.

方法的分離與原代培養(yǎng)乙醚麻醉SD鼠，置700mL/L乙醇消毒1min，超凈工作臺無菌條件下取出后肢股骨與脛骨，斷開骨端，將骨髓細(xì)胞沖至盛有含100mL/LFBS完全培養(yǎng)液的無菌小燒杯中，900r/min離心10min，用含100mL/LFBS的培養(yǎng)液懸浮沉淀細(xì)胞，接種至培養(yǎng)瓶，放置50mL/LCO2,37℃,飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中靜置原代培養(yǎng).

的分離與原代培養(yǎng)mMSC的培養(yǎng)基為含200mL/LFBS的F10與LDMEM培養(yǎng)液，余同rMSC.

表1RTPCR引物的傳代待上述rMSC貼壁細(xì)胞接近80%~90%融合時，用g/L胰酶37℃消化，加入含100mL/LFBS的培養(yǎng)液終止消化，收集細(xì)胞，900r/min離心10min，用含100mL/LFBS的培養(yǎng)液懸浮沉淀細(xì)胞，將細(xì)胞懸液以1∶2或1∶3分配比例接種傳代，2~3d換液1次，倒置相差顯微鏡下逐日觀察、記錄并照相.

,Myf5,myogenin,MRF4和desmin的RTPCR檢測提取細(xì)胞總RNA，ThermoScriptTM逆轉(zhuǎn)錄，PCR擴增，反應(yīng)體系為：10mmol/LdNTP1μL,10×bufferμL,引物上游μL，下游μL，樣品cDNAμL，Tag酶1μL，反應(yīng)總體積50μL；反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2min→94℃變性1min→59~68℃退火1min→72℃延伸1min→最后72℃延伸10min→4℃保存.之后用20g/L瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后置凝膠自動成像儀拍照記錄.

表面標(biāo)志物的檢測收集培養(yǎng)了2d的小鼠骨髓干細(xì)胞的懸浮部分，PBS洗滌3次，加入飽和濃度FITC熒光標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD34FITC抗體，室溫下避光孵育30~45min，PBS洗滌，F(xiàn)ACScan流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原的表達；再用破膜劑破膜，40g/L多聚甲醛固定15min，加入飽和濃度PE熒光標(biāo)記的小鼠抗小鼠desmin抗體，室溫下避光孵育30~45min，PBS洗滌，F(xiàn)ACScan流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞質(zhì)內(nèi)desmin抗原的表達.

2結(jié)果

小鼠與SD大鼠骨髓干細(xì)胞的體外培養(yǎng)C57小鼠骨髓干細(xì)胞的懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞均在離體培養(yǎng)約1wk內(nèi)迅速增殖，之后基本處于停滯狀態(tài)，用一般的培養(yǎng)基培養(yǎng)無法對C57小鼠的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞進行傳代，因為傳代后細(xì)胞基本不增殖.而SD大鼠的原代懸浮細(xì)胞在離體培養(yǎng)3d內(nèi)就迅速增殖，貼壁細(xì)胞潛伏期相對較長，一般10~14d可傳代，生長快的7d就可傳代，傳代后細(xì)胞的生長潛伏期明顯縮短，一般每3d可傳1代，生長快的1~2d就可傳代.隨著傳代次數(shù)的增加，增殖速度逐漸減慢.

2成肌調(diào)節(jié)因子和desmin在不同時期小鼠骨髓干細(xì)胞的表達對新鮮分離，培養(yǎng)2d和7d的懸浮、貼壁C57小鼠骨髓干細(xì)胞成肌調(diào)節(jié)因子和desmin的RTPCR檢測顯示：Myf5和desmin在以上各期細(xì)胞中均有表達，沒有檢測到MyoD,myogenin和MRF4在這些時期小鼠骨髓干細(xì)胞的表達.

M:100bp梯度分子量標(biāo)準(zhǔn)，最亮的條帶代表500bp；p：陽性對照；p0:新鮮分離干細(xì)胞；S2:培養(yǎng)2d懸浮干細(xì)胞；A2：培養(yǎng)2d貼壁干細(xì)胞；S7：培養(yǎng)7d懸浮干細(xì)胞；A7：培養(yǎng)7d貼壁干細(xì)胞.

圖1Myf5與desmin在不同時期小鼠骨髓干細(xì)胞的表達

成肌調(diào)節(jié)因子和desmin在不同代齡大鼠骨髓干細(xì)胞的表達MyoD與desmin在原代至第6代SD大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞中均有表達，沒有檢測到myogenin和MRF4在各代細(xì)胞中的表達.

M：50bp梯度分子量標(biāo)準(zhǔn)，最亮的條帶代表350bp；p0：新鮮分離干細(xì)胞；p1~p6：分別為分離1,2,3,4,5和6d干細(xì)胞.

圖2MyoD與desmin在不同代齡大鼠骨髓干細(xì)胞的表達

骨髓干細(xì)胞表面標(biāo)志物的檢測利用流式細(xì)胞儀采用雙染的方法發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)2d的C57小鼠原代懸浮細(xì)胞中存在CD34與desmin共陽性細(xì)胞.

A：篩選細(xì)胞；B：設(shè)置陰性對照；C：檢測CD34與desmin共陽性細(xì)胞.

圖3流式細(xì)胞儀檢測CD34與desmin共陽性細(xì)胞

3討論

作為轉(zhuǎn)錄因子的成肌調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)著脊椎動物骨骼肌的決定和分化［4］，把轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)移入骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因與干細(xì)胞移植相結(jié)合技術(shù)已成為治療疾病的新思路［5］.

我們的研究表明，對于新鮮分離、

培養(yǎng)了2d和7d的懸浮、貼壁C57小鼠骨髓干細(xì)胞來說，Myf5和desmin在以上各期細(xì)胞中均有表達，我們沒有檢測到MyoD,myogenin和MRF4在這些時期小鼠骨髓干細(xì)胞的表達.這說明骨髓干細(xì)胞的懸浮和貼壁細(xì)胞組分都能表達一定水平的早期肌肉特異性mRNA.在肌肉發(fā)生過程中Myf5是最早表達的成肌調(diào)節(jié)因子.我們的研究結(jié)果與Corti等［6］的研究結(jié)果近似，所不同的是后者還在以上各期細(xì)胞中檢測到MyoD的表達，他們還用免疫細(xì)胞化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)在新鮮分離的C57小鼠的骨髓干細(xì)胞中存在desmin與CD34共陽性的細(xì)胞，我們改進了方法，利用流式細(xì)胞儀采用雙染方法證實培養(yǎng)了2d的C57小鼠的懸浮骨髓干細(xì)胞中存在CD34與desmin共陽性細(xì)胞，從而驗證了他們的發(fā)現(xiàn).Gussoni等［7］的研究就已表明骨髓造血干細(xì)胞移植入動物體內(nèi)后能轉(zhuǎn)化為肌細(xì)胞.張為西等［8］用全骨髓細(xì)胞、造血干細(xì)胞和間質(zhì)干細(xì)胞移植治療mdx鼠時，dystrophin表達率分別為7%,6%和4%.

對成肌調(diào)節(jié)因子和desmin在SD大鼠不同代齡骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的表達的研究表明，MyoD與desmin在原代至第6代骨髓間質(zhì)干細(xì)胞中均有表達，沒有檢測到myogenin與MRF4在各代細(xì)胞中的表達.這說明大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞也能表達一定水平的早期肌肉特異性mRNA.Ratajczak等［9］用RTPCR和流式細(xì)胞儀研究成肌調(diào)節(jié)因子MyoD,Myf5,myogenin以及神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志抗原GFAP和nestin,肝干細(xì)胞標(biāo)志抗原fetoprotein,CK19在新鮮分離的人和小鼠骨髓干細(xì)胞中的表達，結(jié)果表明這些因子在人、小鼠骨髓干細(xì)胞的懸浮細(xì)胞中的表達明顯強于它們在貼壁細(xì)胞中的表達，而且它們主要在CD34+CXCR4+,AC133+CXCR4+組分中表達.

綜上所述，我們的研究證實了未分化的骨髓干細(xì)胞能表達一定水平的早期肌肉特異性抗原，雖然這些組織特異性抗原的表達水平還不足以激活骨髓干細(xì)胞向某一組織特異性細(xì)胞分化，但可為之打下基礎(chǔ).

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