周圍淋巴結(jié)地址素和血管細胞粘附分子-1在妊娠7-d小鼠淋巴結(jié)和子宮的表達

周圍淋巴結(jié)地址素和血管細胞粘附分子_1在妊娠7?d小鼠淋巴結(jié)和子宮的表達【摘要】目的：研究正常小鼠妊娠第7?d子宮和淋巴結(jié)的淋巴細胞歸巢分子［周圍淋巴結(jié)地址素(PNAd)和血管細胞粘附分子_1(VCAM_1)］的分布。方法：應(yīng)用免疫組化染色觀察C57Bl/6小鼠妊娠第7?dPNAd和VCAM_1在子宮和淋巴結(jié)的表達。結(jié)果：在小鼠妊娠第7?d中，PNAd強表達于外周淋巴結(jié)高內(nèi)皮靜脈血管的內(nèi)皮細胞，但在子宮，僅弱表達于子宮內(nèi)膜上皮；VCAM_1弱表達于淋巴結(jié)部分血管內(nèi)皮、淋巴細胞，但廣泛表達于子宮的各層血管內(nèi)皮。結(jié)論：PNAd和VCAM_1在小鼠妊娠第7?d子宮和淋巴結(jié)有各自的分布特點，可能與妊娠期淋巴細胞的分布有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】妊娠子宮淋巴結(jié)周圍淋巴結(jié)地址素血管細胞粘附分子_1

(DepartmentofForensicMedicine,ShantouUniversityMedicalCollege,Shantou515041,China)［Abstract］Objective：Todeterminethedistributionoflymphocyte_homingmolecules［peripherallymphnodevascularaddressin(PNAd)andvascularcelladhesionmolecule_1(VCAM_1)］inthelymphnodeanduterusofC57Bl/6miceatgestationday7.Methods：ImmunohistochemistryassaywasappliedtoobservetheexpressionofPNAdandVCAM_1inthelymphnodeanduterusofC57Bl/6miceatgestationday7.Results：PNAdwasstronglyexpressedintheendothelialcellsofhighendothelialvenules,butweaklyexpressedintheendometriumepithelialcells.VCAM_1wasweaklyexpressedinthepartsofvesselendotheliumcellsandlymphocytesinthelymphnode,butexpressedwidelyinallkindsofvesselendotheliumintheuterus.Conclusion：ThedistributionofPNAdandVCAM_1inthelymphnodeanduterusofC57Bl/6miceatgestationday7issupposedtoberelatedtothedistributionoflymphocytesinthegestation.

［KeyWords］pregnancy；uterus；lymphnode；peripherallymphnodevascularaddressin；vascularcelladhesionmolecule_1對母體來說，胚胎是半同種移植物，但在正常妊娠中，母體卻沒有對胚胎產(chǎn)生排斥。子宮局部免疫微環(huán)境在妊娠過程中扮演重要的角色。早孕時蛻膜部位出現(xiàn)大量的免疫細胞，最引人注目的是大量子宮NK細胞［1，2］。正常小鼠非孕子宮內(nèi)有極少量的NK細胞，妊娠6?d左右開始增多，直至妊娠10?d達高峰(占子宮淋巴細胞總量的70%～80%)，12?d左右開始減少，妊娠結(jié)束時幾乎沒有［3］。這種NK細胞在子宮局部的劇增與該類細胞的增生有關(guān)。研究顯示，妊娠早期子宮NK細胞在蛻膜增多主要是由于骨髓和其他外周淋巴組織中的NK細胞遷移所致［4］。而外周淋巴細胞的定向遷移與該器官局部的淋巴細胞歸巢相關(guān)分子有密切關(guān)系［5］。本研究通過免疫組化觀察C57Bl/6小鼠妊娠第7?d周圍淋巴結(jié)地址素(Peripherallymphnodevascularaddressin，PNAd)和血管細胞粘附分子_1(Vascularcelladhesionmolecule_1，VCAM_1)在子宮和淋巴結(jié)的表達，以探討妊娠子宮NK細胞積聚的機理。

1材料與方法

11實驗動物

健康成年的C57Bl/6小鼠(TaconicFarms公司，美國)按雌雄2∶1合籠，次晨檢查陰栓，陽性者為妊娠第0?d，第7?d時處死，分離淋巴結(jié)(下頜下，腋下，腹股溝，腹主動脈旁等)和子宮，冰凍切片包埋劑包埋，液氮快速冷凍后，_20?℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

12免疫組化染色

冰凍組織制成12?μm厚的切片，室溫晾干2?h，冷丙酮固定10?min，晾干，切片進行免疫組化染色。PBS浸洗5?min，體積分數(shù)03%的H2O2室溫孵育30?min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS浸洗5?min，體積分數(shù)5%的抗血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育20?min。傾去多余血清，一抗［生物素化大鼠抗小鼠PNAd單克隆抗體(BDPharmingen公司，美國)1∶100稀釋；大鼠抗小鼠VCAM_1單克隆抗體(AntigenixAmerica公司，美國)1∶20稀釋］室溫孵育30?min。PBS浸洗5?min，滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記兔抗大鼠IgG(vector實驗室，加拿大)1∶100室溫孵育30?min，PBS浸洗5?min，AB復(fù)合物(vector實驗室，加拿大)室溫孵育30?min，PBS浸洗5?min；DAB顯色2?min，自來水沖洗，蘇木精對比染色，梯度酒精脫水并封固，顯微鏡下觀察并拍照。

2結(jié)果

在C57Bl/6小鼠妊娠第7?d中，PNAd強表達于外周淋巴結(jié)高內(nèi)皮靜脈血管的內(nèi)皮細胞，在這些血管周圍，有大量的淋巴細胞圍繞，可見PNAd陽性細胞呈線狀向外延伸(圖1A，封2)。妊娠第7?d子宮在胚胎著床處明顯增厚，在子宮底蛻膜區(qū)，中膜三角區(qū)和子宮壁均未見PNAd陽性表達，僅弱表達于子宮內(nèi)膜上皮(圖1B，封2)。而VCAM_1表達與PNAd顯著不同，在淋巴結(jié)部位，VCAM_1弱表達于部分血管內(nèi)皮、淋巴細胞(圖2A，封2)，但廣泛表達于子宮各層血管內(nèi)皮(靜、動脈)(圖2B，封2），尤其強表達于中膜三角區(qū)(小鼠妊娠中形成的臨時淋巴細胞聚集區(qū)，妊娠10?d左右，該部位大量子宮NK聚集區(qū))。

3討論

淋巴細胞在中樞淋巴器官發(fā)育成熟后，經(jīng)血流遷移，并在全身各器官、組織以及炎癥部位發(fā)揮多種生物學(xué)功能。淋巴細胞在移行過程中對組織器官具有相對的選擇性，即某一特定的淋巴細胞群或亞群定向歸巢到相應(yīng)的組織或器官。淋巴細胞歸巢過程的分子基礎(chǔ)是淋巴細胞與各組織、器官血管內(nèi)皮細胞粘附分子的相互作用。一般將淋巴細胞的粘附分子稱為淋巴細胞歸巢受體，而將其對應(yīng)的血管內(nèi)皮細胞的粘附分子稱為地址素。多種粘附分子與淋巴細胞的歸巢有關(guān)，但參與不同群或亞群淋巴細胞歸巢過程的粘附分子是不同的［6］。

PNAd是特異性地表達于外周淋巴結(jié)的血管地址素，其與淋巴細胞受體L_selectin結(jié)合介導(dǎo)了淋巴細胞向外周淋巴結(jié)的歸巢。研究表明，PNAd在高內(nèi)皮靜脈樣血管的表達參與了一些疾病的發(fā)生和發(fā)展［7］。子宮NK細胞表達L_selectin，且體外粘附實驗顯示，使用L_selectin抗體可明顯減少NK細胞與蛻膜組織的結(jié)合［8，9］。本研究結(jié)果顯示，雖然在妊娠早期PNAd仍高表達于淋巴結(jié)，但在子宮卻極弱表達，提示PNAd可能并未直接參與妊娠早期子宮NK細胞的歸巢。VCAM_1是一種重要的歸巢分子，多表達于內(nèi)皮、淋巴和單核細胞等［10］。VCAM_1的受體是極遲抗原_4(又稱整合素α4β1)和整合素α4β7。VCAM_1參與體內(nèi)許多炎癥反應(yīng)中淋巴細胞的歸巢。本研究結(jié)果顯示，VCAM_1與PNAd的表達正好相反，弱表達于淋巴結(jié)，但廣泛表達于子宮的各層血管，尤其是子宮NK細胞聚集區(qū)(中膜三角和底蛻膜中央)。本研究提示VCAM_1是招募子宮NK細胞聚集的關(guān)鍵粘附分子，但確切作用和機制還需進一步研究。

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