免疫實驗技術(shù)

關(guān)于免疫實驗技術(shù)第1頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三利用免疫學(xué)原理來檢測抗原、多種免疫分子(抗體、補體、細胞因子和粘附分子等)及免疫細胞的實驗過程。有助于疾病的輔助診斷、治療及預(yù)后判斷。第2頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三

一、凝集反應(yīng)

顆粒性抗原（細胞、細菌等）或吸附于免疫無關(guān)載體上的可溶性抗原與相應(yīng)抗體，在適量電解質(zhì)的存在下，形成肉眼可見的凝集團塊。

1、直接凝集反應(yīng)（1）玻片凝集試驗ABO血型鑒定（2）試管凝集試驗肥達試驗效價（滴度）：以出現(xiàn)明顯抗原抗體反應(yīng)現(xiàn)象的最高稀釋度作為待檢抗原（或抗體）的含量。

第3頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三凝集反應(yīng)（agglutination)顆粒型抗原細菌、細胞＋抗體（凝集素）電解質(zhì)（生理鹽水）＋37℃～50℃數(shù)小時凝集反應(yīng)（凝集成團）第4頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三1.直接凝集試驗玻片法試管法含有已知抗體的診斷血清待檢菌液生理鹽水特點簡便、快速不能定量UUUU待檢血清鹽水簡便、快速能定量肥達氏試驗（widaltest)傷寒、副傷寒已知抗原第5頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三ABO血型鑒定紅細胞表面抗原抗A抗體抗B抗體血型A+-AB-+BH--OA,B++AB第6頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三2、間接凝集反應(yīng)指可溶性抗原(或抗體)吸附在乳膠顆粒或紅細胞等載體表面與相應(yīng)抗體(或抗原)結(jié)合反應(yīng)，在適宜的條件下，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。正向間接凝集反應(yīng)用可溶性抗原包被載體以檢測抗體。反向間接凝集反應(yīng)用抗體包被載體以檢測抗原。第7頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三第8頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三

二、沉淀反應(yīng)可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，當(dāng)兩者比例合適，并有適量電解質(zhì)存在時，形成肉眼可見的沉淀物或沉淀線。

第9頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三沉淀試驗（precipitationtest）可溶性抗原細胞裂解液＋抗體（沉淀素）電解質(zhì)（生理鹽水）＋37℃～50℃數(shù)小時沉淀反應(yīng)（清澄液中出現(xiàn)混濁沉淀）第10頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三沉淀反應(yīng)分類（1）瓊脂擴散試驗a.單向瓊脂擴散試驗

b.雙向瓊脂擴散試驗（2）免疫電泳試驗對流免疫電泳：原理：在陰極孔內(nèi)加抗原，陽極孔內(nèi)加抗體。通電后，抗原帶負電荷較多，分子較小，向陽極泳動；抗體分子帶負電荷較少，加上分子量大，在瓊脂的電滲作用下向陰極泳動。（3）環(huán)狀沉淀試驗

第11頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三（1）單向擴散試驗（Singleredialdiffusiontest）預(yù)先混有抗體第12頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三（2）雙向擴散試驗（Doublediffusiontest）第13頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三（3）對流免疫電泳作用及特點：抗體球蛋白移向陰極，抗原分子移向陽極，當(dāng)兩者在適當(dāng)比例處相遇，即形成灰白色沉淀線。檢查乙型肝炎抗原及甲胎蛋白，敏感度比雙向擴散法高約10倍，只需1～2小時即可獲得檢驗結(jié)果。不能定量測定。AgAb_+第14頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三三、免疫標記技術(shù)原理：利用酶、熒光素、膠體金、發(fā)光物質(zhì)以及放射性核素等標記物來標記抗原或抗體，再與標本中的抗體或抗原反應(yīng)，最后測定復(fù)合物中的標記物。優(yōu)點：特異、敏感、快速，可作定性、定量或定位測定。

第15頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三依據(jù)檢測物分兩類：

1.免疫組化技術(shù)(immunohistochemicaltechnique)，用于組織/細胞中抗原或抗體的定位；2.免疫測定(immunoassay)，用于液體標本中抗原或抗體的檢測。依據(jù)標記物的不同，可分為：酶免疫技術(shù)、熒光免疫技術(shù)、金免疫技術(shù)、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)和放射免疫技術(shù)。

1、酶免疫技術(shù)

酶免疫技術(shù)是以酶標記的抗體或抗原進行抗原抗體反應(yīng)。第16頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)屬固相酶免疫測定ELISA原理：把待測標本(含有未知抗體或抗原)和酶標抗原或抗體按不同的順序與固相抗原或抗體起反應(yīng)，再洗滌固相載體，隨后加入酶的底物，底物受酶催化轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩a(chǎn)物。根據(jù)顏色的深淺對待測物質(zhì)定性或定量。第17頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三三種試劑：①固相抗原或抗體即把抗原或抗體用合適的方法連接到固相載體表面，同時保留它們的免疫活性；②酶標抗原或抗體即把某些酶用合適的方法連接到抗原或抗體表面，同時保留它們的免疫活性以及酶的催化活性。常用的酶是辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AP)；③酶作用的底物常用的底物是鄰苯二胺第18頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三ELISA的類型：

(1)雙抗體夾心法測抗原

1）已知抗體包被2）洗板3）加待檢抗原標本4）洗板5）加酶標記抗體6）洗板7）加底物顯色，測定第19頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三（2）間接法

測抗體

1）己知抗原包被2）洗板3）加待檢病人血清4）洗板5）加酶標記抗人IgG6）洗板

7）加底物顯色，測定（3）競爭法測抗原或抗體測定抗原：在待測管中加入受檢抗原和酶標抗原，使它們同固相抗體進行競爭性結(jié)合。第20頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）間接法Ag待檢血清酶標抗抗體檢測抗體雙抗體法Ag檢測抗原待檢抗原抗原競爭法Ag待檢抗原酶標抗原Ag檢測抗原第21頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三

2、膠體金免疫技術(shù)

以膠體金為標記物的抗原抗體反應(yīng)。常與膜載體技術(shù)結(jié)合，包括斑點金免疫滲濾試驗和斑點金免疫層析試驗等。斑點金