第十章聚合酶鏈式反應技術演示文稿

第十章聚合酶鏈式反應技術演示文稿本文檔共62頁；當前第1頁；編輯于星期三\14點47分第十章聚合酶鏈式反應技術本文檔共62頁；當前第2頁；編輯于星期三\14點47分內容PCR的概念及技術的創(chuàng)建PCR的基本原理及特點PCR的反應體系和條件優(yōu)化PCR產物分析PCR常用技術和應用本文檔共62頁；當前第3頁；編輯于星期三\14點47分KaryBMullis

(1944-)

1983年發(fā)明了PCR技術

1993年度獲得諾貝爾化學獎本文檔共62頁；當前第4頁；編輯于星期三\14點47分本文檔共62頁；當前第5頁；編輯于星期三\14點47分DNA的體內復制：原料：templateDNA（genomicDNA

），RNAprimer，dNTPs酶：解旋酶，引物酶，

DNA聚合酶，連接酶反應條件：胞液環(huán)境，37℃

反應過程：起始（模板DNA解鏈、形成引發(fā)體）、延長、終止（三階段）產物：模板DNA（基因組DNA）拷貝數(shù)增加一倍PCR：templateDNA（genomicDNA，cDNA）,apairofspecificoligonucleotideprimer，dNTPsDNApolymerasebuffer，三種變化的溫度（94，50-70，72℃），cycles（25-35）denaturation、annealing、extension（三階段，多循環(huán)）目的DNA（特異性）拷貝數(shù)增加2n倍本文檔共62頁；當前第6頁；編輯于星期三\14點47分PCR技術的基本原理屬于無細胞的分子克隆，在微量離心管中,加入適量的緩沖液,微量的模板DNA,四種脫氧單核苷酸,耐熱性多聚酶,一對合成DNA的引物,通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;擴增了特異區(qū)段的DNA帶。本文檔共62頁；當前第7頁；編輯于星期三\14點47分Denaturing95?CAnnealingTm-5?CExtension72?CPCR的原理本文檔共62頁；當前第8頁；編輯于星期三\14點47分PCR的過程（1）第一步

變性（denature）94-95oC下5分鐘，模板DNA雙鏈完全變性成單鏈。（2）第二步

復性（anneal）50-60oC下1分鐘，引物與模板復性。①引物的濃度高，②引物的鏈短。本文檔共62頁；當前第9頁；編輯于星期三\14點47分94oC下1分鐘，新合成的DNA雙鏈又變性成單鏈模板。（4）第四步

變性（denature）72oC下1-2分鐘，TaqDNA聚合酶在引物的3‘端上加上核苷酸。（3）第三步

延伸（extend）（5）第五步

重復（repeat）本文檔共62頁；當前第10頁；編輯于星期三\14點47分PCR反應條件變性95℃5min變性95℃1min退火55℃1min延伸72℃1min延伸72℃1min35cycles變性95℃延伸72℃退火Tm-5℃本文檔共62頁；當前第11頁；編輯于星期三\14點47分PCR

PrincipletemplatedenaturatationPrimerannealingPrimerextension本文檔共62頁；當前第12頁；編輯于星期三\14點47分PCR反應的特點特異性強引物與模板結合的特異性及聚合酶的忠實性靈敏度高指數(shù)增長，從pg(10-12)可擴增至mg(10-6)水平簡便、快速2～4小時完成擴增對標本的純度要求低不需要純化，甚至可以直接用細菌。已固定或包埋的組織切片也可以直接用于作模板。本文檔共62頁；當前第13頁；編輯于星期三\14點47分本文檔共62頁；當前第14頁；編輯于星期三\14點47分PCR儀本文檔共62頁；當前第15頁；編輯于星期三\14點47分PCR反應本文檔共62頁；當前第16頁；編輯于星期三\14點47分標準的PCR反應體系10×擴增緩沖液10ul

4種dNTP混合物各200umol/L

引物10～100pmol

模板DNA0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加雙或三蒸水至100ul本文檔共62頁；當前第17頁；編輯于星期三\14點47分自從H.A.Erilish分離出耐高溫的TaqDNA聚合酶，代替大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片斷（37oC)，PCR技術才進入實用階段。（1）TaqDNA聚合酶

PCR體系組成TaqDNA聚合酶的最大特點是熱穩(wěn)定性，耐高溫，非常適合PCR過程的反復高溫變性要求。①

熱穩(wěn)定性本文檔共62頁；當前第18頁；編輯于星期三\14點47分最適溫度：

72-78oC延伸速度：

約1000nt/min酶分子最長延伸長度：6.7kb②

最適溫度高③

Taq酶的功能與缺點具有5’3’聚合酶活性和5’3’外切酶活性，但沒有3’5’外切酶活性。合成超過600bp長度的DNA就有可能出現(xiàn)錯配，用于克隆基因時必須測序。本文檔共62頁；當前第19頁；編輯于星期三\14點47分金屬離子敏感（尤其是Mg2+）。當dNTP（能結合Mg2+）的濃度為時，MgCl2的最佳濃度應是2.0mmol/L。④

TaqDNA聚合酶的激活劑50mmol/LKCl也能激活TaqDNA聚合酶的活性。本文檔共62頁；當前第20頁；編輯于星期三\14點47分與待擴增的模板DNA區(qū)段的兩3’端序列互補（

5‘端相同）的短DNA。（2）引物（primer)①位置3’

3’

本文檔共62頁；當前第21頁；編輯于星期三\14點47分即2.751011bp的基因組中有一次完全與19個核苷酸的序列相同的機會（或機會是約2×10-11）。②引物的長度理論計算：419=2.751011。一般引物設計為長15-30bp。本文檔共62頁；當前第22頁；編輯于星期三\14點47分③引物的堿基序列5’端根據(jù)需要可設計成某個內切酶的切點順序、RNA聚合酶識別序列、突變位點或生物素標記等，方便與以后操作。5’ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3’

3’GCTAGCTACTTAAG5’

3’端必須與模板正確配對，5’端可以不配對。templateprimer本文檔共62頁；當前第23頁；編輯于星期三\14點47分盡可能提高G+C含量，以提高引物與模板的結合力④引物的堿基組成避免連續(xù)相同堿基排列或內部回文序列.

5’GGCAGTCTGCCAGTCTAC3’

CTGCCAGTCTAC3’

GACGG5’

T發(fā)卡結構1）2）本文檔共62頁；當前第24頁；編輯于星期三\14點47分3）避免形成引物二聚體（dimer）兩個引物之間不能有兩個以上的連續(xù)堿基序列互補。5’GGTCTGCCAGTCTAC3’

3’CAGGACTTAGTCACT5’

primer1primer2UpstreamprimervsDownstreamprimerSenseprimervsAntisenseprimerPrimer1vsPrimer2ForwardprimervsReverseprimer本文檔共62頁；當前第25頁；編輯于星期三\14點47分⑤引物的Tm值Tm=（G+C)4+(A+T)2當引物中的（G+C）含量低于50%時，復性溫度低于55oC。適當提高復性溫度可以提高引物與模板結合的特異性，減少非特異產物的出現(xiàn)。實際復性溫度選擇低于Tm值5oC。手工計算：一般估計：本文檔共62頁；當前第26頁；編輯于星期三\14點47分⑥引物的濃度一般使用終濃度各0.2mol/L。⑦簡并引物如果引物的序列是從基因產物蛋白質的氨基酸序列反推出來的，就必須考慮密碼的簡并性。需要合成多種序列的引物，彼此間只有一個或幾個堿基差異。這樣的混合引物稱簡并引物。本文檔共62頁；當前第27頁；編輯于星期三\14點47分設計多組引物，結合位點依次位于前一組引物之間。增加擴增產物的特異性。引物設計現(xiàn)在多用專業(yè)軟件⑧套嵌引物（nestedprimers)1324如Primer6.0等本文檔共62頁；當前第28頁；編輯于星期三\14點47分dNTP呈顆粒狀，保存不當易變性分解dNTP溶液呈酸性，使用時應小量分裝，-20℃冰凍保存，多次凍融會使dNTP降解在PCR反應中，dNTP應為50～200umol/L，濃度過低會降低PCR產物的產量dNTP可與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性（3）dNTP本文檔共62頁；當前第29頁；編輯于星期三\14點47分（4）模板DNA但不能有蛋白質變性劑、DNA酶、Mg2+的螯合劑等影響DNA聚合酶的活性。②

模板的量：不能太多，100l反應體系中100ng足夠。①

純度：PCR對模板DNA的純度要求不高。本文檔共62頁；當前第30頁；編輯于星期三\14點47分Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響在一般的PCR反應中，dNTP濃度200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低

TaqDNA聚合酶的活性，使反應產物減少（5）Mg2+本文檔共62頁；當前第31頁；編輯于星期三\14點47分PCR反應條件優(yōu)化

反應溫度（變性、退火、延伸）反應時間（變性、退火、延伸）循環(huán)次數(shù)（PCR效率及產物量）本文檔共62頁；當前第32頁；編輯于星期三\14點47分1、溫度

變性溫度：94-97℃退火溫度：低于引物Tm5℃左右，一般55-60℃溫度過高：降低擴增效率；溫度過低：增加非特異性擴增延伸溫度：72℃，此時Taq酶具有較高的酶促活性本文檔共62頁；當前第33頁；編輯于星期三\14點47分2、時間

第一次變性應給予足夠時間（5-7分鐘）每一個步驟所需時間取決于擴增片段的長度，一般為復性時間：30～60sec

延伸時間：1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min3-4Kb的DNA片段，延伸時間3-4min10Kb的DNA片段，延伸時間15min本文檔共62頁；當前第34頁；編輯于星期三\14點47分3、循環(huán)次數(shù)

重復次數(shù)一般設為25～35個循環(huán)擴增反應的平臺效應：理論上，PCR反應產物呈指數(shù)性增長，但這種增長形式在擴增25-25個循環(huán)以后便放慢直至停止，達到反應平臺，此時擴增產物量不再隨循環(huán)次數(shù)的增加而呈指數(shù)增長本文檔共62頁；當前第35頁；編輯于星期三\14點47分PCR反應曲線本文檔共62頁；當前第36頁；編輯于星期三\14點47分PCR產物分析

AnalysisofPCRproductsGelanalysis(瓊脂糖凝膠電泳/聚丙烯酰胺凝膠電泳):PCR產物電泳，EB（溴乙錠）染色，紫外儀下觀察，初步判斷產物的特異性。本文檔共62頁；當前第37頁；編輯于星期三\14點47分Restriction-endonucleasedigestionanalysis：酶切、電泳分離。產物的鑒定，基因分型，研究變異性。本文檔共62頁；當前第38頁；編輯于星期三\14點47分Hybridization：

(Southernblot/dotblot)electrophoresis/hybridization本文檔共62頁；當前第39頁；編輯于星期三\14點47分Sequenceanalysis：是檢測PCR產物特異性的最可靠方法。本文檔共62頁；當前第40頁；編輯于星期三\14點47分常用PCR技術原位PCR(insituPCR)多重PCR（multiplexPCR）長距離PCR(Long-rangePCR)逆轉錄PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）熒光定量PCR（fluorescentquantitativePCR）巢式PCR（nestingPCR）-4條引物本文檔共62頁；當前第41頁；編輯于星期三\14點47分原位ＰＣＲ（InsituPCR）原位聚合酶鏈式反應（InsituPCR）是由Haase等于1990年首創(chuàng)。它是利用完整的細胞作為一個微小的反應體系來擴增細胞內的目的片段,在不破壞細胞的前提下,利用一些特定的檢測手段來檢測細胞內的擴增產物。直接用細胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細胞中進行ＰＣＲ擴增?？蛇M行細胞內定位。適用于檢測病理切片中含量較少的靶序列本文檔共62頁；當前第42頁；編輯于星期三\14點47分

原位PCR的作用

利用該法可檢測細胞內病毒感染、細胞內基因重排、以及分析細胞內RNA表達產物等方面發(fā)揮一定作用。在檢測細胞的潛在感染方面也具有重要意義。本文檔共62頁；當前第43頁；編輯于星期三\14點47分多重PCR（MultiplexPCR復合PCR）用于檢測特定基因序列的存在或缺失。本文檔共62頁；當前第44頁；編輯于星期三\14點47分電泳引物12341234本文檔共62頁；當前第45頁；編輯于星期三\14點47分RT-PCR（reversetranscription-PCR）Temin,H.發(fā)現(xiàn)反轉錄酶，1975諾貝爾獎技術關鍵：利用逆轉錄酶，把mRNA反轉錄成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增。本文檔共62頁；當前第46頁；編輯于星期三\14點47分RNAtemplate3’

5’

下游引物cDNAfirststrand3’

5’

上游引物cDNAfirststrandcDNAsecondstrand3’

5’

3’

5’

反轉錄酶Taq酶PCRReversetranscription(RT)下游引物上游引物Taq酶本文檔共62頁；當前第47頁；編輯于星期三\14點47分PCR-RFLP

(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP)

限制性片段長度多態(tài)性1.分析已知突變。2.突變堿基涉及酶切位點的變化。PCR----酶切------電泳本文檔共62頁；當前第48頁；編輯于星期三\14點47分PCR-RFLP5’CCACGG3’3’GGTGCC5’*5’CCATGG3’3’

GGTACC5’*ResistancetoNcoIDigestionSusceptibletoNcoIDigestion本文檔共62頁；當前第49頁；編輯于星期三\14點47分HomozygousMutantHomozygousWild-typeHeterozygoteDirectionofElectrophoresisPCR-RFLP本文檔共62頁；當前第50頁；編輯于星期三\14點47分SSCPPCRPCRATCGWildAmplifyregionofinterestedDenaturesamplesinFormamideorHeatATCGMutant本文檔共62頁；當前第51頁；編輯于星期三\14點47分DenaturesamplesinFormamideandHeatATCGATCGDNAmoleculesconformationdependsontheirsequenceRunonaNon-denaturinggelandlookformobilitydifferencesWildMutantSSCP本文檔共62頁；當前第52頁；編輯于星期三\14點47分點突變位于酶切位點上的點突變：限制性酶切片段分析法不在酶切位點上的點突變：單鏈構象多態(tài)性分析法(PCR-SSCP)

致病基因上的未知點突變：PCR-SSCP（單核苷酸多態(tài)性，SNP）本文檔共62頁；當前第53頁；編輯于星期三\14點47分實時熒光定量PCR(Real-timePCR)常規(guī)定量PCR技術：

—對PCR擴增反應的終產物進行定量

—重復性差

—半定量實時定量PCR技術：對PCR擴增反應中每一個循環(huán)的產物進行定量

本文檔共62頁；當前第54頁；編輯于星期三\14點47分實時熒光定量PCR原理在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。Ct值是熒光定量PCR技術的一個很重要的概