細胞培養(yǎng)工程細胞培養(yǎng)基詳解演示文稿

細胞培養(yǎng)工程細胞培養(yǎng)基詳解演示文稿本文檔共34頁；當前第1頁；編輯于星期二\5點21分（優(yōu)選）細胞培養(yǎng)工程細胞培養(yǎng)基本文檔共34頁；當前第2頁；編輯于星期二\5點21分3細胞培養(yǎng)工業(yè)過程的兩個階段細胞擴增（與化學過程催化劑角色相似）產(chǎn)物形成（蛋白質(zhì)表達）或細胞分化（細胞治療）不同階段分別優(yōu)化細胞培養(yǎng)過程優(yōu)化充分了解細胞的生理需要和代謝特點生長培養(yǎng)基與生產(chǎn)培養(yǎng)基分別優(yōu)化結(jié)合生物反應(yīng)器操作，操縱細胞生長與代謝行為，使過程效益（或效率）最大化細胞生長環(huán)境優(yōu)化細胞培養(yǎng)工程南開大學藥學院本文檔共34頁；當前第3頁；編輯于星期二\5點21分在體內(nèi)，細胞與血液不直接接觸，物質(zhì)交換依賴于龐大的毛細血管網(wǎng)絡(luò)與細胞間質(zhì)中的擴散過程胞間質(zhì)濃度（mM）胞內(nèi)濃度（mM）Na+14014K+4.0140Ca2+1.20.01Mg2+0.720Cl-1084HCO3-28.310HxPO4y-211SO42-0.51Aminoacids28Lactate1.21.5Glucose56Protein24TotalChemicals(mM)301.8302.2CorrectedOsmolarity(mM)281.3281.3體內(nèi)細胞間質(zhì)的化學環(huán)境Source:CellCultureBioprocessEng.pp100細胞培養(yǎng)工程南開大學藥學院本文檔共34頁；當前第4頁；編輯于星期二\5點21分5生物體液血清血漿胚胎提出物淋巴液蛋白質(zhì)水解物天然培養(yǎng)基細胞培養(yǎng)工程南開大學藥學院本文檔共34頁；當前第5頁；編輯于星期二\5點21分6現(xiàn)代培養(yǎng)基類型細胞培養(yǎng)工程南開大學藥學院基底培養(yǎng)基（BasalMedia）糖氨基酸脂肪酸，脂類前體維生素，核苷類普通鹽類，微量元素pH緩沖體系添加物（Supplements）血清生長因子/載體蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)水解物（含）血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基（Serum-freemedia）本文檔共34頁；當前第6頁；編輯于星期二\5點21分7培養(yǎng)基比較細胞培養(yǎng)工程南開大學藥學院復合（血清）培養(yǎng)基

（Complexmedia）血清含量可占到20%成分非完全確定血清植物蛋白質(zhì)水解物大豆磷脂化學定義培養(yǎng)基（Chemicallydefinedmedia）所有成分明確可能含有基因工程表達的蛋白質(zhì)多肽生長因子細胞因子載體蛋白本文檔共34頁；當前第7頁；編輯于星期二\5點21分8培養(yǎng)基比較細胞培養(yǎng)工程南開大學藥學院無血清培養(yǎng)基（Serum-freemedia）不含血清成分完全確定成分非完全確定植物蛋白質(zhì)水解物大豆磷脂無動物成分培養(yǎng)基（Animalcomponent-freemedia)所有成分明確可能含有生長因子細胞因子載體蛋白為了避免動物病毒或朊蛋白污染，無血清培養(yǎng)基或無動物成分培養(yǎng)基已經(jīng)成為工業(yè)標準，貫穿細胞庫構(gòu)建和生產(chǎn)過程。本文檔共34頁；當前第8頁；編輯于星期二\5點21分9培養(yǎng)基比較細胞培養(yǎng)工程南開大學藥學院無蛋白培養(yǎng)基（Protein-freemedia）不含血清不含任何蛋白質(zhì)成分成分可能含有蛋白質(zhì)水解物非成分明確脂類或脂肪酸本文檔共34頁；當前第9頁；編輯于星期二\5點21分細胞培養(yǎng)工程南開大學藥學院化學成分F12DMEMD/F12(1:1)CaCl2CaCl2·2H2OCa(NO3)2·4H2OCuSO4·5H2OFeSO4·7H2OFe(NO3)3·9H2OKClMgSO4MgCl2MgCl2·6H2ONaClNaHCO3NaH2PO4·H2ONa2HPO4Na2HPO4·12H2OZnSO4·7H2O33.220.00240.830.10223.6057.22759911761420.8620040097.6764003700125116.60.00130.4170.05311.848.8428.646995.5243862.571.020.43化學成分F12DMEMD/F12(1:1)丙氨酸精氨酸·H2O天冬氨酸天冬酰胺·H2O半胱氨酸·HCl·H2O胱氨酸胱氨酸·2HCl谷氨酸谷氨酰胺甘氨酸組氨酸·HCl·H2O羥脯氨酸異亮氨酸亮氨酸賴氨酸·HCl蛋氨酸苯丙氨酸脯氨酸絲氨酸蘇氨酸色氨酸酪氨酸酪氨酸·2Na·2H2O纈氨酸8.9021113.315.0135.1214.71467.521413.136.54.5534.510.511.927.8111.7846358430421051051463066429516104944.45147.56.657.5017.5631.297.3536518.7531.4854.4759.0591.2517.2435.4817.2526.2553.459.0255.7952.85化學成分F12DMEMD/F12(1:1)氯化膽堿葡萄糖還原型谷胱甘肽HEPES次黃嘌呤（Na）i-肌醇亞油酸硫辛酸酚紅腐胺·2HCl丙酮酸（Na）胸苷1418024.77180.0840.211.20.1611100.74.045007.2158.9831512.3912.60.0420.1058.10.081550.365化學成分F12DMEMD/F12(1:1)對氨基苯甲酸生物素泛酸鈣葉酸煙酰胺吡哆醛·HC1吡哆醇·HCl核黃素硫胺素·HCl維生素

B120.00730.51.30.0360.060.0370.31.44.04.04.04.00.44.00.00352.242.652.022.00.030.222.170.68基底培養(yǎng)基（mg/L）本文檔共34頁；當前第10頁；編輯于星期二\5點21分11基底培養(yǎng)基成分分類細胞培養(yǎng)工程南開大學藥學院計量性消耗大部分基底培養(yǎng)基成分，包括葡萄糖、氨基酸、維生素、核苷酸、脂類、脂肪酸、部分鹽類、部分生長因子消耗量與胞內(nèi)能量產(chǎn)生、細胞生長和產(chǎn)物生成呈正相關(guān)計量關(guān)系陪伴類大宗鹽類如Na+、Cl-，白蛋白以及某些生長因子胞內(nèi)能量產(chǎn)生、細胞生長和產(chǎn)物生成所需量很小本文檔共34頁；當前第11頁；編輯于星期二\5點21分細胞培養(yǎng)工程南開大學藥學院12pH值范圍多數(shù)細胞系在7.4下生長良好轉(zhuǎn)化細胞系：常用指示劑-酚紅pH7.8紫色pH7.6紅色略帶藍色pH7.4紅色pH7.0橙色pH6.5黃色培養(yǎng)基的物理性質(zhì)

-pH緩沖系統(tǒng)細胞產(chǎn)生CO2和乳酸NaHCO3

緩沖系統(tǒng)生理pH區(qū)間緩沖能力差毒性小成本低HEPES緩沖系統(tǒng)pH7.2-7.6緩沖能力較強濃度：5-20mM成本高本文檔共34頁；當前第12頁；編輯于星期二\5點21分細胞培養(yǎng)工程南開大學藥學院13滲透壓多數(shù)細胞耐受260-320mOsm/kg人細胞漿的滲透壓：290mOsm/kg更高的滲透壓通常會使細胞生長速率減緩，但也?？墒沟鞍桩a(chǎn)物的合成速率加快培養(yǎng)基營養(yǎng)物總濃度上限測量方法Freezing-pointdepressionElevationofvaporpressure培養(yǎng)基的物理性質(zhì)–

滲透壓本文檔共34頁；當前第13頁；編輯于星期二\5點21分細胞培養(yǎng)工程南開大學藥學院14溫度溫度對細胞生長有直接作用；避免溫度過高；在離開細胞培養(yǎng)環(huán)境之后，最好將培養(yǎng)直接置放在碎冰上；過程開發(fā)：在細胞密度達到適合程度時，降低培養(yǎng)溫度（如30oC），阻止細胞生長但不阻止蛋白質(zhì)合成。培養(yǎng)基的物理性質(zhì)–

溫度Q:培養(yǎng)基使用前需要預熱嗎？本文檔共34頁；當前第14頁；編輯于星期二\5點21分細胞培養(yǎng)工程南開大學藥學院15表面張力和泡沫貼壁培養(yǎng)：培養(yǎng)基表面張力可促進貼壁細胞在介質(zhì)上貼附懸浮培養(yǎng)：氣泡形成是為細胞生長提供溶氧的主要機制泡沫會使蛋白質(zhì)變性的速率增加。加入硅油消泡劑降低表面張力，有助于防止泡沫生成泡沫達到培養(yǎng)容器的頂部會增加污染的危險泡沫在液面上的破碎過程是能量快速釋放的過程，會造成細胞的嚴重傷害。PluronicF68

培養(yǎng)基的物理性質(zhì)–

表面張力本文檔共34頁；當前第15頁；編輯于星期二\5點21分細胞培養(yǎng)工程南開大學藥學院16細胞培養(yǎng)基的基本組成（1）水培養(yǎng)基緩沖液主要污染物無機物：包括重金屬、鐵、鈣、氯等。有機物：主要是植物腐敗的副產(chǎn)物和洗滌劑。細菌：熱原。顆粒：主要是氣溶膠物質(zhì)。注射用水（Waterforinjection,WFI）水純化單元操作：過濾、活性炭吸附、超濾、蒸餾、離子交換、反滲透、紫外氧化。大規(guī)模生產(chǎn)：316L不銹鋼；高溫循環(huán)本文檔共34頁；當前第16頁；編輯于星期二\5點21分能源和碳源物質(zhì)六碳糖及糖酵解的產(chǎn)物葡萄糖：5-20mM半乳糖：果糖：Glut-5，少數(shù)細胞種類丙酮酸：主要代謝產(chǎn)物：ATP，乳酸，CO2，

TCA循環(huán)谷氨酰胺：2-6mM消耗量相當于葡萄糖的10-20%蛋白質(zhì)合成為核苷合成提供氨基經(jīng)-酮戊二酸進入TCA循環(huán)脫氨反應(yīng)水溶液自分解血清具有谷氨酰胺酶活性細胞培養(yǎng)基的基本組成（2）Glut-1，大多數(shù)細胞種類本文檔共34頁；當前第17頁；編輯于星期二\5點21分細胞培養(yǎng)工程南開大學藥學院18細胞培養(yǎng)基的基本組成（3）氨基酸：蛋白質(zhì)合成、含氮化合物的前體，能源。必需氨基酸：細胞無法自我合成；谷氨酰胺：細胞能量代謝、蛋白質(zhì)合成；若干其它氨基酸：可能12種，必須從培養(yǎng)基中攝取。非必需氨基酸：其余7種氨基酸可在細胞內(nèi)自己合成，或通過轉(zhuǎn)氨作用由其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化而來；對谷氨酰胺的利用量通常超過其它必需氨基酸的總和；丙氨酸常是被大量生成的氨基酸（谷氨酰胺代謝）；各種細胞對氨基酸的種類和濃度有不同的要求，對氨基酸的利用也有差別，但除了谷氨酰胺外，通常亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、精氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、纈氨酸的利用量較大；脯氨酸為重組CHO細胞所特需，天冬酰胺為某些腫瘤細胞系所必需；甘氨酸有時在葉酸缺乏或甲氨蝶呤和氨基蝶呤存在下需要，絲氨酸常在克隆密度下所必需；具體氨基酸利用情況需要通過氨基酸分析（HPLC）結(jié)果決定，不要被必需/非必需氨基酸生化定義所誤導。本文檔共34頁；當前第18頁；編輯于星期二\5點21分細胞培養(yǎng)工程南開大學藥學院19細胞培養(yǎng)基的基本組成（4）維生素維持細胞正常生理狀態(tài)的重要生物活性化合物，在細胞中多以酶的輔基或輔酶形式存在，對細胞的代謝過程有重要影響。水溶性維生素：生物素、葉酸、煙酰胺、吡哆醛（醇）、泛酸、核黃素、硫胺素、維生素B12、維生素C、對氨基苯甲酸等。脂溶性維生素：維生素A、維生素D、維生素E、維生素K等溶解方法：先高濃度溶于有機溶劑如酒精維生素的用量因細胞而異，但通常培養(yǎng)基中的量已經(jīng)能夠滿足大多數(shù)細胞系的需要。本文檔共34頁；當前第19頁；編輯于星期二\5點21分細胞培養(yǎng)工程南開大學藥學院20細胞培養(yǎng)基的基本組成（5）無機離子大宗離子常見：Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl-、HPO4-、SO42-Na+/K+：細胞膜電位Na+/CI-：維持滲透壓平衡Mg2+：酶反應(yīng)的輔因子Mg2+/Ca2+

：細胞貼附HPO4-/HCO3-:緩沖作用微量元素常見：鐵、錳、鋅、鉬、硒、釩、銅其它：無蛋白長期培養(yǎng)往往需要鈷、鋯、鍺、鎳、錫、鉻、鋁、鋰、溴、碘、硼、氟、硅、鈦、銣、銀、鋇等。試劑等級化學品和添加劑中普遍存在污染物和雜質(zhì)藥典級如USP分析純本文檔共34頁；當前第20頁；編輯于星期二\5點21分細胞培養(yǎng)工程南開大學藥學院21細胞培養(yǎng)基的基本組成（6）脂類和磷脂前體有血清細胞培養(yǎng)：脂類來自于血清無血清/無蛋白培養(yǎng)：需要添加脂類如膽固醇、脂肪酸、磷脂。膽堿：卵磷脂合成前體乙醇胺：腦磷脂合成前體肌醇：肌醇磷脂合成前體核酸前體核酸(RNA/DNA)前體通常不是培養(yǎng)基的必需成分缺陷型CHO細胞：葉酸不足，添加嘌呤類（腺嘌呤和次黃嘌呤）和胸腺嘧啶有益于細胞生長。本文檔共34頁；當前第21頁；編輯于星期二\5點21分細胞培養(yǎng)工程南開大學藥學院22細胞培養(yǎng)基的基本組成（7）非營養(yǎng)性物質(zhì)

調(diào)節(jié)細胞的物理化學環(huán)境，間接影響細胞行為；抗生素：對細胞生長有不利影響，盡量避免；pH緩沖劑：碳酸氫鈉：常用26mM，與5-10%CO2平衡；

HEPES：10-50mM，更高會產(chǎn)生細胞毒性。pH指示劑：酚紅商業(yè)化生產(chǎn)不予采用本文檔共34頁；當前第22頁；編輯于星期二\5點21分血

清主要類型胎牛血清（Fetalbovineserum）小牛血清（Calfserum）馬血清（Horseserum）人血清（Humanserum）主要作用促進細胞貼壁，多數(shù)原代細胞及許多細胞株具有貼壁生長要求；刺激細胞生長與細胞分裂；細胞營養(yǎng)來源；對細胞的保護作用。細胞培養(yǎng)工程南開大學23本文檔共34頁；當前第23頁；編輯于星期二\5點21分血清成份（1）蛋白質(zhì)白蛋白（Albumin）：轉(zhuǎn)運（如脂類）、緩沖與保護功能纖維連接蛋白（Fibronectin）：細胞貼壁胎球蛋白（Futuin）：細胞貼壁（不是甲胎蛋白）巨球蛋白（2-Macroglobulin）：抑制胰蛋白酶

Transferrin（轉(zhuǎn)鐵蛋白）：與鐵結(jié)合，使其失去毒性并轉(zhuǎn)運抗體與補體（Antibodies&complements）：多肽類血小板衍生生長因子（Platelet-derivedgrowthfactor，PDGF）胰島素類生長因子（Insulin-likegrowthfactor，IGFI/II）成纖維細胞生長因子（Fibroblastgrowthfactor，F(xiàn)GF）上皮細胞生長因子（Epidermal

growthfactor，EGF）細胞培養(yǎng)工程南開大學藥學院24本文檔共34頁；當前第24頁；編輯于星期二\5點21分激素胰島素（Insulin）：葡萄糖吸收，刺激有絲分裂；氫化可的松（Hydrocortisone）：貼壁，生長，分化；代謝產(chǎn)物與營養(yǎng)物氨基酸葡萄糖酮酸許多其他營養(yǎng)物和中間代謝物礦物質(zhì)類血清蛋白：微量元素和鐵、銅和鋅硒：與還原型谷胱甘肽一起發(fā)揮抗氧化作用，保護細胞抑制劑細菌毒素細胞培養(yǎng)工程南開大學藥學院25血清成份（2）本文檔共34頁；當前第25頁；編輯于星期二\5點21分取血（Bloodcollection）減少供體動物痛苦；無菌操作；自然凝血（Naturalclotting,4oC）血小板細胞釋放關(guān)鍵生長因子，如

PDGF；離心去除較大固體物質(zhì)；過濾：去除顆粒性物質(zhì)，最終達到無菌微生物污染，包括支原體和噬菌體；膜過濾：1.2、0.8、0.65、0.45、0.22、0.1微米；0.1微米多次。血清的制備方法細胞培養(yǎng)工程南開大學藥學院26本文檔共34頁；當前第26頁；編輯于星期二\5點21分特殊血清透析血清（Dialyzedserum）采用膜透析（生理鹽水），去除干擾小分子化合物活性炭/葡聚糖處理胎牛血清（Charcoal/dextrantreatedFBS）降低類固醇激素含量如黃體酮降低血清批次間差異熱滅活血清（Heatinactivatedserum）血清中補體成分造成干擾30minutesoftreatmentat56oC（水?。│?射線輻射降低血清中潛在病毒濃度106

倍27Source：細胞培養(yǎng)工程南開大學藥學院本文檔共34頁；當前第27頁；編輯于星期二\5點21分篩選品種和批次之間存在生物活性差異；購買前，應(yīng)針對支持細胞生長的能力進行篩選；篩選后，備足夠數(shù)量以供長期使用。冷凍儲藏保持血清成分的生物活性；分裝凍存解凍：2-8oC，期間輕輕混勻以減少蛋白質(zhì)沉淀；解凍后，無菌操作，分裝50毫升無菌離心管；-80oC凍存。注意事項血清的儲藏細胞培養(yǎng)工程南開大學藥學院28本文檔共34頁；當前第28頁；編輯于星期二\5點21分血清質(zhì)量證明CertificatesofAnalysis:FiltrationstatementCountryoforiginCellgrowthperformancetestingMicrobialsterilitytestingScreening:mycoplasmavirusendotoxinhaemoglobinIgGtotalprotein29細胞培養(yǎng)工程南開大學藥學院本文檔共34頁；當前第29頁；編輯于星期二\5點21分血清的主要問題血清原料來源有限血清批次之間生物活性差異較大血清是蛋白質(zhì)藥物生產(chǎn)的主要原料成本之一蛋白質(zhì)藥物純化成本一般占蛋白質(zhì)生產(chǎn)的總成本的50%以上血清會引入大量雜質(zhì)蛋白質(zhì)（如IgG），大幅度增加純化難度和成本BSA：過敏反應(yīng)，藥典安全水平≦50ng/劑量潛在生物污染病毒朊蛋白（瘋牛病）細胞培養(yǎng)工程南開大學藥學院30血清對細胞的負面作用抗體交叉反應(yīng)干擾本文檔共34頁；當前第30頁；編輯于星期二\5點21分胰島素vs胰島素樣生長因子-1（IGF-1）胰島素對許多細胞類型有調(diào)控葡萄糖吸收的作用；在較高濃度時，通過與IGF-1共享信號傳導通路，胰島素