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文檔簡介
誘變育種是指利用物理或化學(xué)誘變劑處理均勻分散的微生物細(xì)胞群,在促進(jìn)其突變頻率顯著提高的基礎(chǔ)上,從中挑選少數(shù)符合目的的突變株,以供科學(xué)實驗或生產(chǎn)實踐使用。
本文檔共42頁;當(dāng)前第1頁;編輯于星期三\13點(diǎn)21分
效價:指有效成分的濃度。1ug/ul稱為1單位1945時間1943194319431947195519711977目前發(fā)酵單位(u/ml)100250500~850~850~8000~2萬~5萬5~10萬
從青霉素產(chǎn)量看誘變育種本文檔共42頁;當(dāng)前第2頁;編輯于星期三\13點(diǎn)21分誘變育種目的提高有效產(chǎn)物的產(chǎn)量改變菌種特性,提高產(chǎn)品質(zhì)量簡化工藝條件開發(fā)新品種本文檔共42頁;當(dāng)前第3頁;編輯于星期三\13點(diǎn)21分誘變育種的過程選擇合適的出發(fā)菌株制備待處理的菌懸液誘變處理篩選保藏和擴(kuò)大試驗本文檔共42頁;當(dāng)前第4頁;編輯于星期三\13點(diǎn)21分
一、誘變育種的實驗準(zhǔn)備(一)誘變前對出發(fā)菌株的了解1、區(qū)分不同菌落類型2、出現(xiàn)不同菌落類型原因出發(fā)菌株本文檔共42頁;當(dāng)前第5頁;編輯于星期三\13點(diǎn)21分(二)全面了解菌種特性和生產(chǎn)性能的關(guān)系(三)了解影響菌種生長發(fā)育的主要因素1、培養(yǎng)基2、斜面培養(yǎng)基的制備技術(shù)3、接種量4、溫度5、濕度6、藥品和原材料質(zhì)量本文檔共42頁;當(dāng)前第6頁;編輯于星期三\13點(diǎn)21分(四)了解菌種有效產(chǎn)物中的各種組分在代謝合成過程中與培養(yǎng)條件的關(guān)系(五)建立一個準(zhǔn)確、簡便、快速檢測產(chǎn)物的方法(六)研究最佳的菌種保藏培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件本文檔共42頁;當(dāng)前第7頁;編輯于星期三\13點(diǎn)21分二、誘變育種的步驟及方法
(一)選擇合適的出發(fā)菌株1、對一般菌株的要求野生菌株對誘變劑敏感最好選用來自生產(chǎn)中的自發(fā)突變菌株。具有有利性狀(如高產(chǎn)、生長速度快、營養(yǎng)要求粗放、標(biāo)記明顯等);可選用已發(fā)生過其他突變的菌株。本文檔共42頁;當(dāng)前第8頁;編輯于星期三\13點(diǎn)21分
2、選擇具有一定生產(chǎn)能力或某種特性的菌株作為出發(fā)菌株3、選擇純種做出發(fā)菌株4、選擇出發(fā)菌株應(yīng)考慮其穩(wěn)定性5、連續(xù)誘變育種過程中如何選擇出發(fā)菌株6、采用多出發(fā)菌株7、了解菌種代謝特點(diǎn)本文檔共42頁;當(dāng)前第9頁;編輯于星期三\13點(diǎn)21分
(三)制備待處理的菌懸液
1、選用單細(xì)胞或單孢子懸液(均勻、分散)目的:①使每個細(xì)胞能均勻接觸誘變劑;②減少表型延遲現(xiàn)象(誘變后性狀的分離及退化現(xiàn)象)同步培養(yǎng)(生理狀態(tài)一致)菌齡:對誘變劑最敏感時期
營養(yǎng)細(xì)胞:對數(shù)期
孢子或芽孢:萌發(fā)前期本文檔共42頁;當(dāng)前第10頁;編輯于星期三\13點(diǎn)21分菌懸液的制備方法物理誘變:生理鹽水配制化學(xué)誘變:緩沖液配制菌懸液的濃度酵母菌,霉菌的孢子:106個/mL細(xì)菌,放線菌孢子:108個/mL不產(chǎn)孢子真菌:采用幼齡菌絲,三種方法制。制備原生質(zhì)體作為誘變材料。本文檔共42頁;當(dāng)前第11頁;編輯于星期三\13點(diǎn)21分誘變劑的選擇(高效,簡便)
物理誘變劑:頻度低、大損傷,難修復(fù),且操作簡便;化學(xué)誘變劑:頻度高,點(diǎn)突變,易回復(fù)突變,操作麻煩。(NTG——超誘變劑)UV是最常用的一種誘變劑(四)誘變劑的選擇及處理方法2、根據(jù)菌種特性和遺傳穩(wěn)定性來選擇誘變劑3、參考出發(fā)菌株原有的誘變譜系來選擇誘變劑本文檔共42頁;當(dāng)前第12頁;編輯于星期三\13點(diǎn)21分常以殺菌率來表示相對劑量(劑量-存活率曲線)
最適劑量:既能擴(kuò)大變異幅度,又能使變異向正突變范圍移動的劑量。(P103)突變率隨劑量的增加而提高,達(dá)一定程度后,再提高劑量,反而會使突變率下降。正變較多出現(xiàn)在偏低劑量中,而負(fù)變較多出現(xiàn)在偏高劑量中。常采用相對殺菌率為70-75%。4.劑量的選擇本文檔共42頁;當(dāng)前第13頁;編輯于星期三\13點(diǎn)21分(五)誘變處理方法單因素處理或多因素的復(fù)合處理:①同一誘變劑的重復(fù)使用;②兩種或多種誘變劑的先后使用;③兩種或多種誘變劑的同時使用;④紫外線光復(fù)活交替處理⑤誘變劑處理時間與誘變效應(yīng)的關(guān)系本文檔共42頁;當(dāng)前第14頁;編輯于星期三\13點(diǎn)21分(六)影響突變率的因素1、菌種遺傳特性不同2、菌體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同3、環(huán)境條件的影響1)誘變前預(yù)培養(yǎng)2)溫度、pH、氧氣等外界條件對誘變效應(yīng)的影響3)菌落密度效應(yīng)本文檔共42頁;當(dāng)前第15頁;編輯于星期三\13點(diǎn)21分表型延遲(phenotypiclag):表型的改變落后于基因型改變的現(xiàn)象.
分離性延遲:
突變的基因經(jīng)DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂后變成純合狀態(tài),表型才能表現(xiàn)出來。
生理性延遲:
由雜合狀態(tài)變?yōu)榧兒蠣顟B(tài),突變表型仍不能表現(xiàn)出來。分離性延遲的原因:
對數(shù)生長期中,單核細(xì)胞常出現(xiàn)雙核現(xiàn)象,多核細(xì)胞的核也成倍增加,誘變對數(shù)期的細(xì)胞時,突變通常發(fā)生在一個核上,故其變異或非變異的細(xì)胞必須經(jīng)過一代或幾代繁殖才能分離,這種純種變異細(xì)胞出現(xiàn)的推遲現(xiàn)象稱為分離延遲現(xiàn)象。生理性延遲的原因:
當(dāng)變異細(xì)胞由雜合狀態(tài)變?yōu)榧兒蠣顟B(tài)時,由于雜合期所合成的非變異的蛋白或酶仍然發(fā)揮作用,必須經(jīng)過細(xì)胞多代分離后,才能將這些非變異的酶稀釋掉,最終達(dá)到變異后應(yīng)該表現(xiàn)的形態(tài),如營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選過程。(四)中間培養(yǎng)(CM,培養(yǎng)過夜)目的:克服表型延遲本文檔共42頁;當(dāng)前第16頁;編輯于星期三\13點(diǎn)21分
初篩復(fù)篩1.初篩(以量為主)(1)利用形態(tài)變異:需預(yù)先測定形態(tài)與產(chǎn)量的相關(guān)性(2)根據(jù)平板顏色反應(yīng)直接挑選透明圈法(蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶);抑菌圈法(抗生素);變色圈法(檸檬酸)、顯色圈(氨基酸);沉淀圈法(外毒素透明圈直徑(H)/菌落直徑(C):產(chǎn)量高低(初篩指標(biāo))方法需簡便、快速2步(五)突變株的篩選本文檔共42頁;當(dāng)前第17頁;編輯于星期三\13點(diǎn)21分(3)濃度梯度法(4)影印平板法(5)瓊脂塊大通量篩選方法本文檔共42頁;當(dāng)前第18頁;編輯于星期三\13點(diǎn)21分2.復(fù)篩(以質(zhì)為主,定量測定)(1)搖瓶培養(yǎng),直接檢測所需產(chǎn)物(2)產(chǎn)物活性檢查瓊脂平板活性圈法紙片法瓊脂薄層紙片法(3)復(fù)篩數(shù)據(jù)的調(diào)整菌落、菌體形態(tài)觀察進(jìn)一步篩選突變株;培養(yǎng)基和條件的調(diào)整;菌株純度及遺傳特性進(jìn)行研究本文檔共42頁;當(dāng)前第19頁;編輯于星期三\13點(diǎn)21分二、誘變育種的基本原則
選擇簡便有效的誘變劑;挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株;處理單細(xì)胞或單孢子懸液;選用最適的誘變劑量;充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng);利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo);設(shè)計高效篩選方案;創(chuàng)造新型篩選方法。本文檔共42頁;當(dāng)前第20頁;編輯于星期三\13點(diǎn)21分1.抗性突變株的篩選(1)抗終代謝物結(jié)構(gòu)類似物突變株的篩選用途:篩選相應(yīng)代謝物的高產(chǎn)菌株三、幾種重要突變株的篩選方法結(jié)構(gòu)類似物(又稱代謝拮抗物)是指那些在結(jié)構(gòu)上和代謝終產(chǎn)物(氨基酸、嘌呤、維生素等)相似的物質(zhì)。如:異煙肼(“雷米封”)是吡哆醇的結(jié)構(gòu)類似物,利用含異煙肼梯度平板篩選異煙肼抗性突變株,可達(dá)到定向培育吡哆醇高產(chǎn)突變株的目的。本文檔共42頁;當(dāng)前第21頁;編輯于星期三\13點(diǎn)21分
(2)抗藥性突變株用途:篩選相應(yīng)藥物(抗生素)的高產(chǎn)菌株或遺傳標(biāo)記制作
篩選的方法:
a.高于臨界濃度的平板進(jìn)行分離;b.梯度平板法
敏感菌苔
抗性菌落加入含異煙肼的上層
加入不含異煙肼的底層
本文檔共42頁;當(dāng)前第22頁;編輯于星期三\13點(diǎn)21分(1)幾個概念:基本培養(yǎng)基(MM)[-]:某野生型能生長的最低成分的組合培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基(CM)[+]:各種營養(yǎng)缺陷型能生長的天然或半組合培養(yǎng)基補(bǔ)充培養(yǎng)基(SM)[A]:[-]+A,[B]:[-]+B相應(yīng)營養(yǎng)缺陷型能生長的組合或半組合培養(yǎng)基
2.營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選本文檔共42頁;當(dāng)前第23頁;編輯于星期三\13點(diǎn)21分三種遺傳型:野生型(wildtype)從自然界分離到的、發(fā)生營養(yǎng)缺陷型突變前的原始菌株。[A+B+],可在[-]生長。營養(yǎng)缺陷型(auxotroph)野生型菌株經(jīng)誘變劑處理后,由于發(fā)生了喪失某種酶合成能力的突變,因而只能在加有該酶合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基中才能生長的突變菌株(主要指合成維生素、氨基酸及嘌呤、嘧啶的能力)。[A+B-]:能在[+]、[B]生長[A-B+]:能在[+]、[A]生長[A-B-]:能在[+]生長原養(yǎng)型(prototroph)營養(yǎng)缺陷型經(jīng)回復(fù)突變或重組,回到原來野生型的營養(yǎng)要求[A+B+],可在[-]生長本文檔共42頁;當(dāng)前第24頁;編輯于星期三\13點(diǎn)21分(2)篩選步驟(5步)誘變處理中間培養(yǎng)淘汰野生型檢出缺陷型鑒定缺陷型本文檔共42頁;當(dāng)前第25頁;編輯于星期三\13點(diǎn)21分①中間培養(yǎng)CM或SM培養(yǎng)基,培養(yǎng)過夜??朔硇脱舆t。②淘汰野生型即濃縮缺陷型,以提高檢出率
饑餓培養(yǎng)(無N)MM6~12h2N培養(yǎng)(2N)MM1~2h加抗生素(或菌絲過濾),培養(yǎng)過夜
抗生素法(G+細(xì)菌:青霉素;酵母菌和霉菌:制霉菌素)
菌絲過濾法(絲狀真菌、放線菌)方法本文檔共42頁;當(dāng)前第26頁;編輯于星期三\13點(diǎn)21分③營養(yǎng)缺陷型的檢出方法逐個檢出法夾層培養(yǎng)法限量補(bǔ)充培養(yǎng)法影印平板法本文檔共42頁;當(dāng)前第27頁;編輯于星期三\13點(diǎn)21分④營養(yǎng)缺陷型的鑒定分兩步:a.三大類營養(yǎng)要求(氨基酸、維生素、核苷酸)的鑒定b.具體到某一種營養(yǎng)要求的鑒定(哪一種氨基酸,哪一種維生素,或哪一種堿基)具體操作:一般采用“濾紙片法”生長譜法:快速,直觀本文檔共42頁;當(dāng)前第28頁;編輯于星期三\13點(diǎn)21分
a.不含維生素的酪素水解液或氨基酸混合液
b.維生素混合液c.0.1%堿水解酵母核酸液a
b
c三大類營養(yǎng)要求的鑒定本文檔共42頁;當(dāng)前第29頁;編輯于星期三\13點(diǎn)21分以氨基酸缺陷為例進(jìn)行說明將21種氨基酸按右表分為6組特點(diǎn):每2組只有一種共同物質(zhì)單一營養(yǎng)物質(zhì)要求的鑒定:組別化合物代號1178910112271213141533812161718449131619205510141719216611151820211
352
4
6本文檔共42頁;當(dāng)前第30頁;編輯于星期三\13點(diǎn)21分(3)營養(yǎng)缺陷型的用途生產(chǎn)菌(氨基酸、核苷酸、維生素等高產(chǎn)菌需求);研究代謝途徑和雜交、轉(zhuǎn)化等遺傳規(guī)律的遺傳標(biāo)記。本文檔共42頁;當(dāng)前第31頁;編輯于星期三\13點(diǎn)21分
1.從生產(chǎn)中選育
2.定向培育優(yōu)良品種
一般指用特定因素長期處理微生物群體,同時不斷地對它們進(jìn)行移種傳代,以達(dá)到積累并選擇相應(yīng)的自發(fā)突變株的目的。例:卡介苗(牛型結(jié)核分枝桿菌的減毒活菌苗)三、自發(fā)突變與育種本文檔共42頁;當(dāng)前第32頁;編輯于星期三\13點(diǎn)21分思考題1、
誘變劑主要有哪三類?2、簡述紫外線照射誘變育種的原理、方法和基本步驟。3、化學(xué)誘變劑主要有哪些種類?4、烷化劑的作用機(jī)制是什么?5、簡述亞硝基胍誘變育種的原理、過程和安全注意事項。6、生物誘變劑按照誘變方式主要分為哪三類?為什么在篩選突變株時,不能直接用代謝產(chǎn)物,而必須用其結(jié)構(gòu)類似物?本文檔共42頁;當(dāng)前第33頁;編輯于星期三\13點(diǎn)21分一、電離輻射致DNA的損傷
電離輻射損傷DNA途徑:直接作用指射線直接作用于DNA分子,通過電離和激發(fā)使DNA受到損傷。間接作用指射線與DNA周圍其
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