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免疫分析技術(shù)之ELISA廣東省功能蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室王娟免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)細(xì)胞水平分子水平基因水平體外(或體內(nèi))測(cè)定各類細(xì)胞及其亞群的數(shù)量和效應(yīng),從而了解機(jī)體的細(xì)胞免疫水平測(cè)定各類免疫球蛋白、補(bǔ)體、細(xì)胞因子及其受體、黏附分子的表達(dá)水平和生物活性,從而了解機(jī)體免疫因子間的相互關(guān)系測(cè)定免疫應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá)與調(diào)控、免疫分子的遺傳多態(tài)性及基因型別分析ELISA概念酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay,ELISA),是在免疫酶技術(shù)(immunoenzymatictechniques)上發(fā)展起來的一種新型免疫測(cè)定技術(shù),基礎(chǔ)是:抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化成為有色產(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),由此進(jìn)行定性或定量分析。酶免疫測(cè)定類型

這種固相酶免疫測(cè)定方法在1971年最初建立時(shí)稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定,簡(jiǎn)稱ELISA。酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫測(cè)定均相酶免疫測(cè)定非均相酶免疫測(cè)定固相酶免疫測(cè)定液相酶免疫測(cè)定1.1抗原抗體反應(yīng)

可逆性抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過程是一種動(dòng)態(tài)平衡,其反應(yīng)式為:Ag+Ab→Ag·Ab抗體的親和力(affinity),可以用平衡常數(shù)K表示:K=[Ag·Ab]/[Ag][Ab],Ag·Ab的解離程度與K值有關(guān)。高親和力抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合,兩者結(jié)合牢固,不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。特異性

抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點(diǎn)之間?;瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補(bǔ)關(guān)系,具有高度的特異性。

測(cè)定某一特定的物質(zhì),而不需先分離待檢物。

敏感性化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平酶反應(yīng)測(cè)定法的敏感度約為5-10μg/ml免疫測(cè)定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿標(biāo)記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍,達(dá)ng/ml水平例如,HBsAg,其敏感度可達(dá)0.1ng/ml。1.2免疫測(cè)定在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用由于各種抗原成份,包括小分子的半抗原,均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體,利用此抗體作為試劑就可檢測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原,因此免疫測(cè)定的應(yīng)用范圍極廣?;驹恝偈箍乖蚩贵w結(jié)合到某種固相載體表面,并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體,這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性,又保留酶的活性。③在測(cè)定時(shí),把受檢標(biāo)本(測(cè)定其中的抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開,最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。④由于酶的催化頻率很高,故可極大地地放大反應(yīng)效果,從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。2吸EL久IS祝A的愧類型EL汪IS膀A可淘用于克測(cè)定懷抗原垃,也把可用忽于測(cè)溜定抗裙體。狀在這乘種測(cè)貿(mào)定方艦法中王有三尖個(gè)必恐要的小試劑店:(1骨)固爽相的交抗原忌或抗苦體,手即"或免疫額吸附槐劑"(i胳mm谷un因os躍or筋be拐nt銷);(2溪)酶董標(biāo)記戰(zhàn)的抗甜原或迎抗體稼,稱墾為"貝結(jié)合羊物"(c灑on拴ju案ga扁te赤);(3漲)酶潑反應(yīng)供的底冰物??稍O(shè)陷計(jì)出蛾各種堡不同族類型稠的檢基測(cè)方倉(cāng)法。2.予1炭雙抗億體夾編心法宅測(cè)抗勉原A.頸將抗射體吸茂附于閑固相宿表面芬;B.旁加抗另原,弱形成得抗原梨-抗耐體復(fù)誕合物糾;C.愧加酶舒標(biāo)抗儉體;D.井加底怕物。擠底物鮮的降堪解量漁=抗波原量柿。此法森適用嫩于檢驕測(cè)各并種蛋垃白質(zhì)夫等大久分子府抗原音,例禁如H六Bs府Ag殲、H肝Be古Ag參、A販FP寫等。梳只要秘獲得僅針對(duì)洗受檢案抗原窯的特責(zé)異性健抗體鄉(xiāng)豐,就浙可用似于包考被固立相載設(shè)體和足制備稈酶結(jié)懶合物喘而建編立此凍法。2.溝2被雙抗家原夾絮心法湊測(cè)抗閥體用特葛異性小抗原杜進(jìn)行逃包被償和制分備酶謹(jǐn)結(jié)合稼物。彈此法虜中受說檢標(biāo)餃本不柔需稀昨釋,尋可直看接用開于測(cè)姨定,添因此洗其敏域感度祥相對(duì)奮高于南間接均法。貌乙肝蠶標(biāo)志障物中燭抗H達(dá)Bs撈Ag否的檢絮測(cè)常海采用脈本法賓。本練法關(guān)廁鍵在門于酶界標(biāo)抗至原的拼制備造,應(yīng)臘根據(jù)具抗原悶結(jié)構(gòu)介的不尋同,遺尋找趁合適廚的標(biāo)炸記方普法。2.訓(xùn)3愈間接細(xì)法測(cè)言抗體傳染吊病的惰診斷各。間否接法文的優(yōu)竄點(diǎn)是鹽只要鄙變換奇包被蒜抗原鏡就可堂利用抽同一愈酶標(biāo)崗抗抗雀體建銅立檢訴測(cè)相邁應(yīng)抗殘?bào)w的爸方法。A.蘭將抗督原吸情附于采固相誘載體罪表面晨;B.捕加抗談體,蔽形著成抗堤原-脂抗體品復(fù)合輔物;C.瞞加酶掩標(biāo)抗獲體;D.移加底流物。鐘測(cè)販定底查物的嗚降解孔量=肺抗體窮量2.肥4司競(jìng)爭(zhēng)曬法測(cè)鋸抗體當(dāng)抗羽原材楚料中鑼的干會(huì)擾物阿質(zhì)不扣易除葵去,筋或不噴易得飯到足玻夠的升純化述抗原懇時(shí),凍可用菊此法難檢測(cè)展特異丙性抗線體。2.孔5腦競(jìng)御爭(zhēng)法紙測(cè)抗煉原小分面子抗凳原或滅半抗暖原缺隨乏可刊作夾責(zé)心法庭的兩擴(kuò)個(gè)以菊上的胳位點(diǎn)弓,因懂此不紗能用慈雙抗睡體夾就心法圖進(jìn)行辣測(cè)定宅,可云以采時(shí)用競(jìng)蠅爭(zhēng)法報(bào)模式斷。其卷原理資是標(biāo)激本中隔的抗松原和粘一定臂量的倡酶標(biāo)兼抗原消競(jìng)爭(zhēng)洋與固擦相抗逮體結(jié)未合。員標(biāo)本壩中抗莊原量褲含量狹愈多侵,結(jié)論合在別固相宮上的傷酶標(biāo)束抗原勻愈少考,最印后的廚顯色端也愈扭淺。開小分登子激存素、易藥物居等E直LI誼SA惑測(cè)定櫻多用疼此法廟。2.臭6圓捕獲縫包被乞法測(cè)僅抗體Ig誘M的售檢測(cè)滲常用峽于傳婆染病含的診猴斷。戴用抗永人I炭gM硬抗體那包被剃固相我,以語(yǔ)捕獲贏血清候標(biāo)本漆中的漁Ig沾M(印其中明包括償針對(duì)遙抗原棉的特狼異性率Ig閥M抗慎體和娃非特業(yè)異性通的I葬gM恥)。察此法靈常用睬于病老毒性華感染蓋的早折期診哀斷。2.今7批AB嘉S-玻EL愉IS咬A法①:爪固相賣支持弟物;②:捷樣品貴;③:肥特異吸性I賴gG盈;④:浮生物注素化記抗小腔鼠I撕gG踐(螺Bi枕ot目in此);⑤:煌辣根針過氧膽化物范酶H慢RP扔-酶缸標(biāo)鏈憐親和尿素(趙Av軟id路in投);⑥:舅DA艷B顯齊色液國(guó);⑦:嚇顯色擔(dān);3.愉EL窩IS級(jí)A的燈試劑塞(A仰、B南、C租三部爭(zhēng)分)EL咽IS卻A中船有三饞個(gè)必爆要的屢試劑固:免斷疫吸吸附劑篩、結(jié)憂合物饒和酶封的底執(zhí)物(1勒)已構(gòu)包被證抗原趨或抗扯體的修固相籃載體尺(免谷疫吸深附劑弊);(2嗎)酶茫標(biāo)記疫的抗奶原或梯抗體遺(結(jié)靠合物賠);(3棉)酶叫的底吹物;(4態(tài))陰揭性對(duì)督照品養(yǎng)和陽(yáng)嘴性對(duì)龍照品搏,參科考標(biāo)暮準(zhǔn)品忙;(5集)結(jié)約合物鄭及標(biāo)叉本的茂稀釋塊液;(6濕)洗霜滌液古;(7襯)酶妙反應(yīng)畫終止緣瑞液EL筒IS塔A的繳試劑拋準(zhǔn)備直A固相楚載體聚苯另乙烯啟,具轉(zhuǎn)有較伴強(qiáng)的棗吸附毛蛋白輸質(zhì)的崇性能礎(chǔ),抗另體或失蛋白當(dāng)質(zhì)抗拉原吸污附其舟上后獅仍保乖留原耍來的度免疫托學(xué)活背性。聚氯禍乙烯鄰,聚翻氯乙君烯對(duì)貧蛋白綱質(zhì)的盞吸附僚性能富比聚餅苯乙享烯高策,但百空白泳值也湖略高天。良好勉的E爺LI副SA黨板應(yīng)劫該是吸附篇性能賴好,雷空白盤值低谷,孔摧底透距明度闊高,創(chuàng)各板迫之間止、同萍一板看各孔絮之間解性能黨相近作。3.扭1.訪2貢包反被的拾方式將抗奇原或齡抗體然固定腦的過宿程稱拒為包襪被(鐵co候at撕in葉g)雞。蛋白接質(zhì)與輸聚苯旨乙烯借固相匪載體釋是通繡過物恒理吸零附結(jié)勿合的丙,靠況的是匹蛋白流質(zhì)分織子結(jié)良構(gòu)上膠的疏兼水基痕團(tuán)與祥固相偶載體相表面宰的疏肚水基份團(tuán)間晨的作哲用。匠這種巡壽物理穗吸附廢是非曉特異姜性的洪,受拉蛋白課質(zhì)的啟分子陸量、販等電珍點(diǎn)、翁濃度安等的決影響逢。大澆分子昏蛋白慈質(zhì)較養(yǎng)小分拳子蛋眾白質(zhì)贏通常換含有敵更多簡(jiǎn)的疏尺水基杜團(tuán),違故更滾易吸棟附到楚固相吩載體語(yǔ)表面莖。不易沾吸附蒜的非賊蛋白碎質(zhì)抗枕原可用歷間接給包被房誠(chéng)的抗肉原經(jīng)耽固相閥抗體的的親瞞和層耽析作繪用,次包被獨(dú)在固媽相上騰的抗魂原純贊度大過大提鑰高,屋因此濤含雜刺質(zhì)較繭多的駕抗原扁也可改采用鎖捕獲拉包被占法。親和鵲素生旨物素即用俯親和型素先弦包被老載體肢,加閑入生茄物素姑化的辨DN竭A,碗這種旁包被啄方法扁均勻貴、牢齒固,辯已擴(kuò)勒大應(yīng)氏用于其各種寶抗原獵物質(zhì)倉(cāng)的定嘗量測(cè)臣定。脂類叨物質(zhì)無法良與固互相載使體結(jié)返合,陽(yáng)可將遵其在級(jí)有機(jī)咽溶劑像(例部如乙泥醇)芝中溶棋解后殊加入歲EL墳IS踐A板押孔中緊,開元蓋置粗冰箱宏過夜遷或冷悶風(fēng)吹御干,歡待酒鄉(xiāng)豐精揮卷發(fā)后而,讓劍脂質(zhì)療自然桶干固減在固添相表里面。天然綁抗原瓦、重俯組抗?fàn)吭兔锖铣晒┒嚯念^抗原屑三大盞類。合成凍多肽孝抗原諸是抗舟原決鑼定簇哭的氨沃基酸愁序列箱人工苦合成述的多細(xì)肽片亡段。你一般化只含然有一俘個(gè)抗民原決棚定簇最,純損度高畏,特摩異性葵也高堆,但茄由于嬸分子內(nèi)量太基小,濫往往捆難于柔直接案吸附雪于固裝相上枯。借滾助于憑偶聯(lián)咐物與離固相錫載體小的吸厘附,怨間接爸地結(jié)蜘合到握固相告載體腳表面。3.咬1.銜3翻包松被用譜抗原3.租1.戚4跌包暈被用用抗體Ig探G對(duì)伸聚苯缺乙烯槳有強(qiáng)估吸附柴力,謎其聯(lián)憐結(jié)發(fā)嬸生在抄Fc角段上里,抗愛體結(jié)傭合點(diǎn)揭暴露沖于外外。取材青于抗香血清弄或含焰單克炒隆抗妖體的擊培養(yǎng)驢液,塌須除倉(cāng)去雜慕抗體稀后才墻能用醫(yī)于E惡LI稿SA側(cè),以救保證地試驗(yàn)郵的特逼異性粥。腹水歷中單俱抗的皆濃度沙較高仔,特乎異性竟亦較內(nèi)強(qiáng),腥因此這不需鏟要作膊吸收味層析毒處理室,直前接包兇被。重在某拘些情戲況下量,用光多種芝單抗杯混合安包被濱,可袖取得辯更好小的效慚果。3.雁1.弟5暑包絲式被的敗條件pH遷9字.6測(cè)碳酸下鹽緩身沖液pH梁7緊.2攀的磷早酸鹽放緩沖酸液pH銀7趴-8灰的T那ri蝦s-咬HC筑L緩紫沖液加入鍛包被舒液后冷,在滴4-耕8℃澇冰箱芳中放陵置過用夜,貝37圾℃中藍(lán)保溫聰2小磁時(shí)。封包被播濃度贈(zèng)隨載巡壽體和慰包被舍物的書性質(zhì)矛可有天很大容的變?cè)刍?,錦每批桶材料昌需通蓋過實(shí)綁驗(yàn)與犁酶結(jié)比合物樣的濃誕度協(xié)除調(diào)選寬定。染一般蛋白充質(zhì)的惑包被哪濃度唯為1忙0n村g/愿ml盈-2襯0u瞇g/剪ml勤。3.奇1.應(yīng)6解封是閉封閉胳(b縱lo御ck狐in器g)先是繼扭包被疾之后裕用高公濃度不的無古關(guān)蛋予白質(zhì)箏溶液唯再包留被的喚過程逝。封矛閉就勒是讓匪大量葛不相案關(guān)的撿蛋白敢質(zhì)充綿填這危些空旋隙,拋從而播排斥瓶EL虹IS復(fù)A后勇的步慰驟中教干擾沉物質(zhì)概的再和吸附芝。常用寺封閉長(zhǎng)劑:仍0.杏05伏%-團(tuán)0.宇5%怖的B屆SA靈;猜10謎%的薯小牛導(dǎo)血清儀或1煙%明恥膠;梨脫脂躬奶粉遞,比癥較價(jià)忽廉,捷可以聰高濃戒度使嗽用(緩5%蓬)。所有兇的E千LI涉SA戰(zhàn)固相頭均需斬封閉厲?EL搜IS魔A的試嗓劑準(zhǔn)父?jìng)銪3.踏2啊結(jié)經(jīng)合物即酶鄙標(biāo)記漏的抗墊體(慈或抗享原)蒼是E拐LI膨SA拋中關(guān)覺鍵的射試劑1灘酶的和催化隙活性2席抗體較(或襪抗原勸)的稀免疫副活性3消含有金或少保含有杏游離炊的抗縱體(運(yùn)或抗巷原)4價(jià)結(jié)合慈物尚催要有稅良好錘的穩(wěn)午定性3.合2.絮1水結(jié)嚼合物振用的櫻抗原農(nóng)和抗易體制備妻結(jié)合傲物時(shí)精所用匹純度丹較高針的I賣gG懲,以羽免在鐮與酶風(fēng)聯(lián)結(jié)摸時(shí)其筒他雜武蛋白叼的干逢擾。插最好腔用層兩析純賠化的紅抗體代,這合樣全贊部酶義結(jié)合喊物均縣具有遞特異們的免役疫活浮性,征可以茫在高述稀釋聲度進(jìn)達(dá)行反亂應(yīng),抬實(shí)驗(yàn)股結(jié)果倆本底節(jié)淺淡蟲。在恰EL嗚IS幟A中皆用酶御標(biāo)抗匆原的痰模式贏不多利,總探的要?jiǎng)?lì)求是葡抗原柏必須兵是高燭純度靠的。酶純度嘩高,餓催化塵反應(yīng)智的轉(zhuǎn)拜化率婦高,敏專一旁性強(qiáng)脆,性咱質(zhì)穩(wěn)傭定,窯來源播豐富窗,價(jià)蒙格不健貴,括受檢葵標(biāo)本難中不覺存在傷相同槍的酶混。酶結(jié)曲合物催保留伯活性撥部分稿和催疤化能喜力,育底物譜易于腳制備俊和保車存,叛價(jià)格塌低廉護(hù),有煌色產(chǎn)揀物易疲于測(cè)聰定等簡(jiǎn)。在E減LI黨SA卻中,HR再P,A酬P(guān),夕葡萄臨糖氧珍化酶疫,β柿-D剪-半與乳糖椒苷酶旦和脲步酶等漲。辣根縫過氧混化物孟酶H惕RP是一樹種糖殖蛋白名,含籃糖量辟約為才18雜%,摸分子瓜量為副44業(yè)00贈(zèng)0,走是一飯種復(fù)疏合酶朗,由肢主酶只(酶甩蛋白接)和驢輔基汗(亞內(nèi)鐵血濁紅素洲)結(jié)檔合而斥成,漠是一桐種卟頭啉蛋歪白質(zhì)寧。酶標(biāo)召記抗妖體的奧制備物方法蹈主要燈有兩嬸種,儉即戊沃二醛燃交聯(lián)被法和摧過碘灣酸鹽物氧化邁法。(1柳)戊描二醛魯交聯(lián)艦法:完戊二恩醛是舊一種卷雙功峰能團(tuán)販試劑擾,可籃使酶稿與蛋段白質(zhì)憲的氨堡基通幣過它導(dǎo)而聯(lián)黨結(jié)。恨有效亦(結(jié)鍋合率鋼達(dá)6臂0%潮-7們0%狹)和牽重復(fù)俘性好添。交聯(lián)天反應(yīng)名是隨較機(jī)的憑,結(jié)凝合物逼的大趁小也毛不均恥一,菠酶與脆酶,件抗體疏與抗結(jié)體之糖間也份有可凍能交孔聯(lián),辰影響啦效果休。(2盯)過死碘酸踏氧化洞法:夢(mèng)適用凱含糖幅量較宿高的南酶。益過碘傭酸鈉過將H顆RP夢(mèng)分子宴表面腿的多暖糖氧娛化為高醛基各很活筒潑,關(guān)可與浪蛋白鍵質(zhì)上扁的氨患基形冤成c琴hi莫ff這氏堿仗而結(jié)根合。遠(yuǎn)簡(jiǎn)便預(yù)有效蛋.3.勸2.也3聲結(jié)合閘物的織制備結(jié)合佩物中催混有耕的游某離酶獅一般濟(jì)不影泰響E熄LI腹SA留中最恨后的訂酶活識(shí)性測(cè)屠定??艿位j離的糊抗體是則會(huì)疲與酶清標(biāo)抗谷體競(jìng)疏爭(zhēng)相偵應(yīng)的時(shí)固相館抗原醫(yī),因雖此制軟備的糕酶結(jié)辛合物購(gòu)應(yīng)予裕純化挽,去獎(jiǎng)除游軟離的駝酶和修抗體振后用鏟于檢榆測(cè),礙效果額更好焦。制得煙結(jié)合義物,遠(yuǎn)最適鄭的工墊作濃糕度就般是指州結(jié)合伙物稀句釋至溉這一允濃度猛時(shí),境能維排護(hù)一侮個(gè)低鵝的本殼底,拾并獲挑得測(cè)朵定的虎最佳泉靈敏撈度,停達(dá)到忠最合菊適的曠測(cè)定速條件炕和測(cè)禿定費(fèi)神用的押節(jié)省摩。酶和貞抗體帖均為束生物慘活性?shī)W物質(zhì)忽,易役失活診。高忌濃度死較為拘穩(wěn)定苦,凍算干后喜可在閉普通般冰箱鹽中保大存一禽年左它右。嫩結(jié)合親物溶摘液中混加入窗等體污積的南甘油拳,加晌入蛋昏白保但護(hù)劑屠。另爺外再浙加入侄抗生庫(kù)素(掙例如枝慶大戰(zhàn)霉素燥)和茄防腐砍劑(惱HR乒P結(jié)該合物幫加硫嬸柳泵脆,A貸P結(jié)罪合物攀可加帆疊氮寶鈉)購(gòu)。3.贈(zèng)2.跡4趨結(jié)合塊物的暢保存用于頓稀釋勇高濃井度的癥結(jié)合修物以績(jī)配成扯工作得液。矛為避塵免結(jié)輝合物弊在反射應(yīng)中蜜直接曠吸附悲在固記相載獅體上腦:0酷.1偉%牛校血清親白蛋趴白,熊0纏.0喂5%測(cè)吐溫貿(mào)20忘。運(yùn)試劑黃盒均委已用腸合適哀的緩摧沖液題配成嗓工作狂液,厘使用吐時(shí)不錢需再爛行稀疑釋,駛在4遙-8電℃保游存期筒可達(dá)釀6個(gè)串月。3.某2.信5唐結(jié)合隨物的翻稀釋試劑朱準(zhǔn)備C酶的悠底物3.附3東酶蜜的底勤物3.持3.臉1訊H棵RP安的底舊物OP撲D氧巡壽化后搏的產(chǎn)長(zhǎng)物呈苦橙紅肌色,烈用酸份終止踏酶反鹽應(yīng)后朽,在候49肝2n布m處摟有最談高吸奶收峰對(duì),靈嚷敏度返高,麗比色托方便土,是貞HR罵P結(jié)誘合物緣瑞最常抹用的嶄底物西。DH2+H2O2D+2H2O上式中,DH2為供氧體,H2O2為受氫體。DH2一般為無色化合物,經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。DH2如:鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和ABTS。TM崗B經(jīng)宜HR圖P作利用后他共產(chǎn)閉物顯裁藍(lán)色蛇。T神MB惕性質(zhì)啊較穩(wěn)江定,超可配辛成溶乞液試聯(lián)劑,卷只需侮與H2O2溶液暗混和亦即成莊應(yīng)用律液。憑酶反頸應(yīng)終耳止后丘,T斬MB迅產(chǎn)物理由藍(lán)腫色呈倆黃色償,可廈在比賤色計(jì)撕中定拆量,危最適設(shè)吸收宴波長(zhǎng)挨為4更50哈nm氣。AB耕TS安雖不破如O蒼PD練和T哭MB徒敏感飯,但旅空白雞值極籃低,渠也為煎一些季試劑救盒所田采用仔。HR定P對(duì)汽氫受物體的旁專一臣性很晉高,籍僅作充用于松H2削O2過、小逐分醇亂的過棗氧化者物和思尿素火過氧狹化物屬(u里re示a訪pe記ro副xi現(xiàn)de辯)。AP毒的底駝物為結(jié)磷酸傳酯酶攜,一缺般采喂用對(duì)嫌硝基柜苯磷外酸酯抽作為扁底物燒。產(chǎn)撫物為宴黃色學(xué)的對(duì)患硝基蔥酚,攔在4屬05豎nm嶺波長(zhǎng)錘處有畜吸收襪峰。魯用N槍aO漲H終壇止酶銹反應(yīng)圈后,泄黃色箏可穩(wěn)匹定一慮時(shí)間遵。A墳P也呆有發(fā)刊熒光斧底物莖(磷見酸4榆-甲趨基傘筑酮)穴,可景用于持EL匠IS鋒A作皆熒光像測(cè)定與,敏阿感度票較高平于用費(fèi)顯色蔽底物看的比屯色法卵。4份對(duì)照貓?jiān)O(shè)定陽(yáng)性匹對(duì)照毫品(艷po仆si舌ti艇ve脅c仿on傻tr族ol全)和偏陰性沃對(duì)照鈔品(花ne砌ga眾ti怪ve眼c傳on獸tr喬ol陸)是覺檢驗(yàn)狹試驗(yàn)遍有效靜性的旨控制矩品,報(bào)同時(shí)邁也作災(zāi)為判陵斷結(jié)舅果的漲對(duì)照汁。陽(yáng)性渠對(duì)照引品的蘆基本撥組成喚應(yīng)盡己量與犧檢測(cè)賠標(biāo)本棒的組展成相族一致送,多桶以含壤蛋白坡保護(hù)虜劑的社緩沖康液為爪基質(zhì)飛。加入乖的量漠應(yīng)與楊試劑荷的敏姑感度西相稱注;在測(cè)望定中州得到蓮的吸末光值懷與受舉檢標(biāo)曬本吸陰光值詳比較理,可仿以估壤計(jì)標(biāo)蔥本物桿質(zhì)的懲量。參考類標(biāo)準(zhǔn)世品定量平測(cè)定壓(如價(jià)甲胎搶蛋白蓬質(zhì),張癌胚纏抗原奮測(cè)定詞等)餐應(yīng)含欠有制辭作標(biāo)啄準(zhǔn)曲幣線用渾的參滋考標(biāo)庸準(zhǔn)品陜,應(yīng)筐包括披覆蓋疼可檢撈測(cè)范累圍的蕩4-背5個(gè)臨濃度這,一蛇般均健配入佛含蛋司白保使護(hù)劑密及防溪腐劑月的緩若沖液棋中。陰性死對(duì)照井品須習(xí)先行沿檢測(cè)局確定是不含穿待測(cè)嫁物質(zhì)軋。例首如H嚇Bs美Ag影檢測(cè)斗的陰陣性對(duì)杠照品倒中不仆可含礦HB僵sA輔g,駛最好棵抗H觀Bs梯也是汪陰性栽。5閥標(biāo)本軋的采平取和臘保存體液之、分陣泌物斥和排雨泄物遲等均罩可作惹標(biāo)本車以測(cè)絨定其篩中某駐種抗卡體或陽(yáng)抗原柳成份蒜。以血索清標(biāo)泄本為昆例:裂血漿府中除逝尚含掛有纖進(jìn)維蛋鐮白原蹲和抗植凝劑內(nèi)外,房誠(chéng)其他視成份示同血建清。腔血漿歲和血扣清可竿同等喚應(yīng)用途。血清繁標(biāo)本海應(yīng)避稻免溶夕血:控紅細(xì)辮胞溶美解時(shí)沃會(huì)釋移放出蘿具有介過氧己化物斥酶活曬性的飛物質(zhì)容,以胞HR裁P為姑標(biāo)記保的E銜LI叨SA邊測(cè)定圖中,口可能們會(huì)增葉加非歐特異統(tǒng)性顯駛色。加樣在E嗎LI逢SA喚中一暴般有渴3次俘加樣煩步聚堪,即億加標(biāo)叉本,蘿加酶語(yǔ)結(jié)合馳物,如加底恨物。幟加樣信時(shí)應(yīng)播將所服加物泥加在帖LE垮IS缺A板報(bào)孔的薪底部還,避異免加集在孔陷壁上盯部,蒙并注前意不貿(mào)可濺花出,甚不可版產(chǎn)生警氣泡震?;究宀僮麟H注意洪事項(xiàng)保溫抗原伴抗體化完成價(jià)反應(yīng)領(lǐng)的保候溫過始程稱董為溫毒育(霧in今cu做ba獻(xiàn)ti鬼on晚)。EL舅IS肯A屬押固相師免疫季測(cè)定略,抗踢原、督抗體扁的結(jié)東合只命在固殿相表政面上苦發(fā)生廟。為黎什么筒EL來IS剛A反僑應(yīng)總簽是需嘩要一道定時(shí)妻間的旬溫育改?溫育朗常采擱用的蠅溫度數(shù)有4推3℃殊、3程7℃厘、室爺溫和屆4℃唯(冰疼箱溫液度)讀等。哪37敬℃是動(dòng)實(shí)驗(yàn)畜室中盼常用賊的??釡販乩倍龋逡彩茄复蠖喑鈹?shù)抗滋原抗辮體結(jié)招合的咸合適躍溫度蠶。洗滌洗滌斜在E茂LI食SA港過程納中雖否不是疾一個(gè)甘反應(yīng)釣步驟攏,但初卻也乏決定么著實(shí)雜驗(yàn)的侵成敗郊。EL仇SI影A洗附滌:繞達(dá)到踢分離宋游離柄的和想結(jié)合坡的酶報(bào)標(biāo)記叉物的奧目的槍。清除濕殘留康在板沾孔中被游離銹的物吵質(zhì),肚以及學(xué)非特役異性僵地吸環(huán)附的模干擾填物質(zhì)講。聚戴苯乙城烯等鎮(zhèn)塑料寨對(duì)蛋叫白質(zhì)駛的吸甜附是申普遍懂性的放,而向在洗垮滌時(shí)泊又應(yīng)座把這靜種非公特異挺性吸巴附的百干擾勺物質(zhì)鳥洗滌架下來奪??梢院勒f在闊EL鎖IS所A操咐作中限,洗奇滌是殖最主朽要的仁關(guān)鍵止技術(shù)挪。洗滌來的方捏式除脅某些梨EL照IS妹A儀詢器配婆有特疼殊的交自動(dòng)彼洗滌膽儀外叔,手唇工操飼作有滅流水惜沖洗踩式和收浸泡懷式兩辜種:(1信)流叉水沖效洗式獅流水燙沖洗紛法最固初用寸于小往珠載粉體的斯洗滌萌,洗子滌液勉為蒸怒餾水炊,自尋來水卻。洗架滌效甘果更透為徹時(shí)底,濁且也姻簡(jiǎn)便騎、快淚速。越已有氧實(shí)驗(yàn)掃表明膝,流暫水沖告洗式褲同樣麥適用傘于微黑量滴牽定板料的洗蛇滌。首讓水烘流沖百擊板喪孔表叉面,蝴洗滌取效果延更佳擦。(2紫)浸吩泡式鋪微量領(lǐng)滴定拖板多暢采用餐。洗矩滌液現(xiàn)為非寸離子婚型洗萬(wàn)滌劑蜜的中棚性緩蠻沖液漢。聚歲苯乙河烯載艱體與終蛋白壘質(zhì)的烤結(jié)合引是疏介水性疫的,杜非離籃子型叔洗滌傷劑既槽含疏煤水基邪團(tuán),頌也含掘親水湖基團(tuán)葬,使秧蛋白薪質(zhì)回叫復(fù)到嬌水溶態(tài)液狀躲態(tài),橋從而棟脫離劫固相廉載體縱。顯色顯色蜜是酶檔催化兆無色穿的底造物生待成有淋色產(chǎn)歲物的襲溫育紹反應(yīng)估。反皂應(yīng)的面溫度疲和時(shí)憐間仍招是影票響顯牧色的司因素窗。在吹一定抓時(shí)間讓內(nèi),酬陰性燒孔可臉保持擦無色耐,而茅陽(yáng)性荷孔則轉(zhuǎn)隨時(shí)贈(zèng)間的鐵延長(zhǎng)瓣而呈疊色加閉強(qiáng)。蠻適當(dāng)餓提高尼溫度尺有助蝦于加纖速顯濱色進(jìn)叨行。TM植B受蠢光照亭的影肚響不果大,顯可在獅室溫景中置挨于操醒作臺(tái)蓬上,愚邊反訴應(yīng)觀性察結(jié)棟果。更但為傘保證邀實(shí)驗(yàn)竟結(jié)果柔的穩(wěn)董定性并,宜懂在規(guī)墳定的沃適當(dāng)篩時(shí)間墾閱讀總結(jié)果薄。T幸MB屯經(jīng)H彎RP殺作用悟后,洪約4元0分孩鐘顯標(biāo)色達(dá)除頂峰納,隨批即逐來漸減鳴弱,早至2歡小時(shí)便后即典可完堤全消員退至災(zāi)無色鹽。比色拭干逢板底充附著逗的液櫻體,政然后駕將板呆正確怕放入從酶標(biāo)臺(tái)比色過儀中笛。以蒸長(zhǎng)餾水報(bào)校零鈴點(diǎn),有測(cè)讀竭底物憑孔(問未經(jīng)秩任何潑反應(yīng)其僅加產(chǎn)底物滴液的雙孔)恐和空寺白孔論(以態(tài)生理秀鹽水否或稀占釋液鴨代替紀(jì)標(biāo)本牢作全播過程鉗的孔踐),煙以記藥錄本德次試哈驗(yàn)的銷試劑索狀況楚。其必后可哥用空精白孔享以蒸賊餾水題校零他點(diǎn),像以上弟各孔誤的吸義光度火需減幣去空瓜白孔壩的吸鼓光度丘,然根后進(jìn)懶行計(jì)究算。結(jié)果沉以光權(quán)密度揪(o中pl梯ic診al爐d擺en醫(yī)si交ty擊,O漲D)咱,現(xiàn)葛按規(guī)支定用捧吸光仆度(棚ab奏so暈rb撈en擾ce舞,A索),公兩者尖含義剛相同誼。通泄常的壺表示到方法糊是,掃將吸周收波葉長(zhǎng)寫中于A榆字母橋的右暑下角似,如絡(luò)OP灶D的贏吸收竿波長(zhǎng)芬為4諷92觀nm物,表衡示方義法為列"A49幻玉2nm笑"或凱"O化D49成2nm搭"。酶標(biāo)撤比色吸儀酶標(biāo)客比色薯儀簡(jiǎn)蠻稱酶雙標(biāo)儀街,通樸常指鵝測(cè)讀討EL樸IS篇A光大度計(jì)較。針腐對(duì)固棍相載吩體形析式的槐不同柄,各情有特稠制的拍適用值于板屋、珠外和小忘試管京的設(shè)樸計(jì)。致酶標(biāo)陜儀的娘主要葛性能茫指標(biāo)絨有:驅(qū)測(cè)讀沒速度早、讀路數(shù)的而準(zhǔn)確寨性、映重復(fù)綢性、廁精確循度和州可測(cè)孔范圍傭、線澆性等愧等。沾優(yōu)良蕩的酶撇標(biāo)儀涌的讀蠶數(shù)一棕般可起精確舞到0屆.0貓01葡,準(zhǔn)姓確性干為±貢1%堵,重茫復(fù)性州達(dá)0除.5午%。操作吐時(shí)室桿溫宜讀在1枯5-斃30撤℃,緒使用姜前先震預(yù)熱捷儀器端15割-3黎0分之鐘,紀(jì)測(cè)讀暮結(jié)果教更穩(wěn)喉定。嚇測(cè)讀怎A值叢時(shí),應(yīng)要選懸用產(chǎn)萌物的傷敏感黎吸收鉆峰,搭如O達(dá)PD貓用4它92生nm右波長(zhǎng)傳。有液的酶障標(biāo)儀偶可用擺雙波葵長(zhǎng)式鳳測(cè)讀什。各種混酶標(biāo)繪儀性吸能有蛇所不父同,悟使用夾中應(yīng)舟詳細(xì)莫閱讀嗽說明屯書。6扇結(jié)果肢判斷6.贈(zèng)1素定性饒測(cè)定定性壁測(cè)定執(zhí)的結(jié)釣果判窮斷作灑出“招有”迅或“辭無”明的回困答,桂分別舟用“綢陽(yáng)性互”、閑“陰定性”萍表示魚。在窗這種短半定探量測(cè)兄定中鉤,將竿標(biāo)本草作一仔系列詢稀釋洲后進(jìn)否行試具驗(yàn),茄呈陽(yáng)踢性反艱應(yīng)的辭最高票稀釋弦度即夠?yàn)榈螤I(yíng)度。丹根據(jù)以滴度葵的高域低,伍可以扔判斷逗標(biāo)本堤反應(yīng)隊(duì)性的工強(qiáng)弱茶,這殼比觀述察不教稀釋速標(biāo)本竊呈色芽的深漠淺判戀斷為輸強(qiáng)陽(yáng)竄性、撓弱陽(yáng)辟性更悟具定兼量意寸義。在間香接法罵和夾桑心法陸EL泰SI侍A中赴,陽(yáng)魯性孔挽呈色痰深于蘿陰性觀孔。容在競(jìng)費(fèi)爭(zhēng)法炒EL合IS辭A中懸則相闖反,鎮(zhèn)陰性灰孔呈閣色深啦于陽(yáng)諷性孔透。兩多類反乘應(yīng)的困結(jié)果觀判斷熊方法井不同蝕,分架述于斷下。A.援陽(yáng)性盜判定生值:巡壽(兵cu難t-柴of繪f棋va氏lu容e)一般興為陰漏性對(duì)士照A情值加晌上一江個(gè)特盾定的跡常數(shù)歷(0厲.0斥5)西,以繳此作紫為判典斷結(jié)睡果陽(yáng)日性或站陰性圈的標(biāo)燃準(zhǔn)。B.按標(biāo)本甜/陰舒性對(duì)貿(mào)照比棋值:母在實(shí)謙驗(yàn)條擱件(沉包括宋試劑廢)較匹難保在證恒份定的交情況贈(zèng)下,活這種謙判斷日法較魂為合湯適。貸在得蹤蝶出標(biāo)艘本(桌S)綿和陰總性對(duì)汪照(迫N)渠的A紋值后妨,計(jì)溜算S褲/N碧值。間接追法和鎮(zhèn)夾心所法(2渴)競(jìng)發(fā)爭(zhēng)法因肉遷眼很渡難辨束別弱劈燕陽(yáng)性酒反應(yīng)愛與陰棉性對(duì)宏照的請(qǐng)顯色沃差異昌,一蓬般均醉用比殼色計(jì)廈測(cè)定獻(xiàn),讀刮出S保、P既和N遣的吸躺光值鹽。a.砌陽(yáng)丈性判桐定值魚法陰性孩判定洗值=稿0.折4×賴NC監(jiān)X+育0.倡6×超PC橡X陽(yáng)性箭A爬≤陽(yáng)午性判桃定值陰性酒A邁>陽(yáng)判性判哄定值b.克抑號(hào)制率碑法抑制餓率(室%)災(zāi)=也(陰示性對(duì)泳照A激值-嫁標(biāo)本張A值仔)×端10靈0%京/陰輩性對(duì)逃照陽(yáng)性挪抑男制率負(fù)≥5蠶0%施為陰性殲<狗50趣%4.企7.汽2惑定懂量測(cè)縫定EL腎SI某A操皇作步銅驟復(fù)參雜,女影響侵反應(yīng)海因素碼較多劑,特?zé)齽e是信固相允載體遣的包鳥被難潔達(dá)到肺各個(gè)夏體之過間的媽一致娘,因便此在條定量洗測(cè)定硬中,順每批倒測(cè)試辱均須轎用一績(jī)系列靈不同讓濃度么的參姻考標(biāo)礎(chǔ)準(zhǔn)品印在相祥同的捆條件咐下制橡作標(biāo)沿準(zhǔn)曲考線。測(cè)定姐大分姻子量便物質(zhì)雙的夾堡心法息EL殼IS敢A,排標(biāo)準(zhǔn)琴曲線取的范艱圍一鹿般較午寬,糠曲線如的值龍逐點(diǎn)績(jī)連接艦,所如得曲金線一息般呈道S形浴,其逮頭、和尾部本曲線恩趨于點(diǎn)平坦恭,中娃央較叫呈直伙線的向部分鑄是最倦理想譯的檢重測(cè)區(qū)床域。4.家E韻LI土SA煌的操棟作要安點(diǎn)嚴(yán)謹(jǐn)編的設(shè)陪計(jì),銷優(yōu)質(zhì)菜的試母劑,屆正確勇的操思作和熟良好站的儀爬器是逢保證標(biāo)EL賊IS難A必克要條省件。嚴(yán)格搬遵照蟲規(guī)定踩操作材,必工能得蘆出準(zhǔn)活確的加結(jié)果映。免疫岡分析身技術(shù)訓(xùn)之液相我芯片班技術(shù)禿及應(yīng)歌用廣東巡壽省功裁能蛋俗白質(zhì)登組重牧點(diǎn)實(shí)伴驗(yàn)室王圣娟li世qu慨ic節(jié)hi瞧p液相忙芯片鐮系統(tǒng)婆_(tái)_解_液相炭芯片龜系統(tǒng)喂有機(jī)勝地整武和了考有色肆微球亂(c逼ol味or絕-c女od伶ed漏m折ic膨ro廳sp醋he盞re圖o僅r貝be鼻ad準(zhǔn))、佛激光遵技術(shù)鈔、流耗體學(xué)翠、最右新的盯高速陳數(shù)字膽信號(hào)輝處理旁器和果計(jì)算懷機(jī)運(yùn)胡算法尸則,刷造就談了L巾um激in雄ex圣1藝00臟無與嬸倫比址的檢猾測(cè)特異劫性和批靈敏糾度。Be盞ne羅fi免tsAp跳pl穩(wěn)ic貪at敞io晶nsFu載tu禁reTe擾ch狗no嶼lo完gyPr艙in虛ci灘pl侮eMo證st春b律io齒as石sa哲ys為c研on咱si啦st莖o汪f洪tw銷o澇or豪m(xù)槽or涉ebi錫om蕩ol態(tài)ec活ul而es退i畝nt桶er段ac功ti科ngPr碌in假ci犧pl吳eUs總in局g榨Li晝qu氣iC土hi鳳p-渡Te沃ch號(hào)no泊lo敘gyth魯es捎e常bi顛ol肆og普ic偷al繞i法nt綱er拆ac妄ti松on堪s裁ta狐ke此p餓la陜ce棵o杯n耐sm處al盟l,mi月cr這os帖co映pi就ca盲lbe鄭ad胞sth敘es貨e羊be歸ad逆s租ar生e存fl仰uo束re想sc吸en突t嚇(r崇ed杜)Pr貝in連ci迎pl踩eDe酷t(yī)e畏ct神io鈴n戀an穴d困Qu膽an黨ti丸ta劇ti拋on施o刪f咽th內(nèi)es渾e嬌bi垮ol徑og棟ic陪al眠i嚼nt雞er寄ac竭ti夸on膠s坑is炕m羞ad揪e演by柱f恩lu泛or徐es鄭ce奪nt犬d茶et稠ec擋ti郊o(jì)n醋r把ea登ge偵nt萌sBe純ad柄s球形醉基質(zhì)Ca材pt粥ur簡(jiǎn)e勾mo役le嚼cu誘le探針職分子An笛a(bǔ)l市yt牽e待檢背測(cè)物Re撲po私rt脂er姑m簽ol挺ec格ul秘e報(bào)告能分子As竟sa負(fù)ys菊o設(shè)n伯Un首if同or熔m琴P暈ol鄭ys斥ty耽re荷ne逢(聚苯蠻乙烯)Be祖ad蕩sDi氣am乓et泄er其5仰.6叢μ余mTw步o環(huán)in計(jì)te摸rn努al巨D(zhuǎn)煉ye殖s痕fo不r拒Be離ad波C癢la塊ss炮if并ic象at懷io榴nDe聚fi慘ne逢d霜Mi太xt躲ur慶e削Dy刮in幫g捎in處S碎hr陽(yáng)in湯ki費(fèi)ng垂i神nof茶b極ot堡h紙Dy睜es托Or緩ga株ni盜c莖So種lv鋒en槐t郵Aq撫ue每ou造s錘So眾lv性en批tTw容o-趕Co飾lo慶r燃Be賤ad改-C磁od嚷in積gBa脖se新d俱onxMA亂P毫te絲式ch征no擔(dān)lo便gyBy鮮u蹤蝶si剝ng械1蜻0棄di煩ff美er穩(wěn)en天t圣le躬ve擋ls關(guān)o謙f窩ea醉ch叨o杏f步tw肺o壘fl亦uo杰re皺sc斃en面t塞dy哲es襖,筋an透a情rr分ay勢(shì)o握f按10堆0享be攻ad乞s,患e它ac工h墾wi蒜th累a盈u柔ni推qu子e紹co長(zhǎng)lo螞r稈si側(cè)gn辜at枝u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InteractionassaysRe懲al管iz套e規(guī)th煮e原Po襯we蝕r碗of掘S彼us介pe找ns悶io旨n呈Ar姥ra阿ysAs香sa培y債sy濕st漸em遵t神ha籮t催of付fe點(diǎn)rs疫:mu洗lt前ip述le某xi社ng當(dāng)o扮f販as愚sa跑ys咬u賣p模to潛a腥f(wàn)贊ac浪to托r厘of某1廳00a大mi投x-摟an莫d-販me忽as良ur妙e階pr典oc秧ed劑ur松es見(北no樂w寸as安hi老ng素)su午sp傲en蜓si賢on水e優(yōu)nz盟ym堅(jiān)e輝as遵sa塑ys鵝(淚ki良na歌se絞,咳ph巨os灑ph言at簡(jiǎn)as射e課an摟d粗pr某ot遺ea枝se搏a朽ss逐ay包s)Aut皂oi策mm圓un絕eAS櫻CAHu魂ma化nbe謀ta蟲-2哭M恒ic瞞ro轎gl分ob側(cè)ul膊inHu孫ma臉nMo備us過eCe嘆nt卻ro微me乏re晶BHu壟ma棉nCh繩ro群ma稼ti雕nHu壩ma陵nEN繳A押Pr刪of亡il云e激4嶄(S挖SA錯(cuò),秧SS懸B,網(wǎng)S灶m,遙R勤NP思)Hu寨ma過nEN膀A棋Pr屈of燦il勒e申5近(S座SA遍,恢SS肉B,照S太m,荒R驚NP后,絲式Sc卸l-兇70旅)Hu普ma蔽nEN公A策Pr筑of遠(yuǎn)il怨e巖6貪(S退SA購(gòu),埋SS旬B,門S趙m,員R鵝NP陳,仇Sc布l-棉70壘,屬Jo鋤-1輩)Hu窮ma鏈nHi播st販on繞eHu耳ma舉nHi孩st淘on丟e蠶H1Hu稼ma京nHi剛st鑼on謀e勉H2慘AHu翻ma賭nHi菠st恥on勻e銅H2群BHu圓ma屠nHi剃st梯on衫e手H3Hu伯ma潮nHi羊st齒on興e禽H4Hu壇ma妄nHS疼P-職27良p保S8蛙2Ge絕ne鞏ra虹lHS剖P-對(duì)27西T秋ot紹alGe臨ne辣ra芹lHS遲P-劫32Hu難ma母nHS羊P-賤65Hu吊ma拐nHS賢P-藍(lán)71Hu彈ma利nHS邀P-旦90拿aHu杰ma晴nHS票P-央90織bHu只ma纖nJo輕-1Hu踢ma紗nPC宣NAHu奸ma噸nMo喂us瓣ePR治3Hu寨ma培nPR及3兼(c拌AN祥CA撞)Mo衰us浙eRi炒bo緒so號(hào)ma勤l宜PHu拍ma歪nMo昂us忘eRN年P(guān)Hu煤ma礎(chǔ)nMo邀us尋eRN接P-遺AHu鎮(zhèn)ma課nRN杏P-修CHu麻ma掃nSC勁FHu歸ma身nMo吧us晨eSc灑l-炮70Hu含ma帖nMo羅us勒eSe屯ru你m潑Am館yl潑oi濱d增PHu狡ma甘nSL唇E互Pr弟of距il閃e光8范(S乓SA刊,刺SS要B,咐S遙m,樸R鋒NP著,斜Sc嬸l-另70河,嗓Jo錄-1慰,亮Ri榴bo嗓so巴me涂-P尿,奏ch慎ro曠ma船ti箭n)Hu鞋ma榮nSmGe蕉ne搖ra剛lHu而ma世nSm受it叮hMo憶us授eHu軋ma曠nSS胸AHu只ma授nMo楊us吐eSS捉BHu薯ma腫nMo勉us歡eSt雞re按pt燙ol徹ys饑in加OHu房誠(chéng)ma浙nTP侍OHu過ma目nMo上us插e(cuò)Al岔le妨rg唱y鞭Te依st賢in宜gAl廊te拜rn年ar騎ia文(動(dòng)Mo勇ld乎)Hu耗ma研nBe雷rm逗ud艇a查Gr器as盾sHu臘ma蚊nCa歷t海Da拒nd賊erHu弦ma河nEg私g斷Wh秤it移eHu起ma爬nMi陪lkHu朗ma有nMi逝te倍P洞te領(lǐng)rn節(jié)oy篇ss膀in塵usHu貿(mào)ma錫nMo旨un疊ta琴in替C毒ed風(fēng)arHu息ma黃nSh望or釀t濤Ra舌gw蜻ee鹿dHu明ma武nTi須mo母th魚y型Gr盆as趁sHu易ma同nWh堆ea膊t辜(f柄oo麥d)Hu票ma父nCa慌nc威er叫M銷ar原ke塌rsal尊ph蟻a押Fe鐮to艷pr議ot登ei規(guī)nHu桂ma沒nCa丸nc跟er漢A僚nt千ig懶en堪1等25Hu淡ma閃nCa點(diǎn)rc筑in挑oe介mb腦ry州on儉ic勤A斧nt逐ig右enHu偵ma踢nPS鑰A,榨F千re豎eHu稍ma脂nCa測(cè)rd掀ia似c恭Ma屑rk輛er站sCr離ea幻玉ti哄ne粗K拔in賢as臥e-體MBHu揪ma憂nEn水do溝th早el止in土-1Mo山us觀ePA降PHu逼ma雜nSG魔OTHu朗ma短nMo勒us據(jù)eTI鋒MP及-1Hu殖ma鼻nMo柴us沈eCy氧to驗(yàn)ki孤ne晉sBD甘NFHu乘ma捆nCR億EB蹈p氧S1刺33Ge冶ne拌ra顏

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