異位寧對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠子宮內(nèi)膜異位癥表皮生長(zhǎng)因子受體的影響

異位寧對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠子宮內(nèi)膜異位癥表皮生長(zhǎng)因子受體的影響【摘要】目的：探討異位寧對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠子宮內(nèi)膜異位癥表皮生長(zhǎng)因子受體表達(dá)水平的影響。方法：以免疫組化法定性檢測(cè)各組子宮內(nèi)膜異位大鼠的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的表達(dá)水平。結(jié)果：模型對(duì)照組EGFR的陽(yáng)性表達(dá)率偏高，與正常對(duì)照組比較有顯著差異，異位寧高劑量組中EGFR的陽(yáng)性表達(dá)率明顯偏低，與模型對(duì)照組相比有顯著差異()。結(jié)論：異位寧可以抑制異位內(nèi)膜血管的形成，從而抑制異位子宮內(nèi)膜增生,為研究子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制開(kāi)拓了新途徑。

【關(guān)鍵詞】子宮內(nèi)膜異位癥異位寧表皮生長(zhǎng)因子受體大鼠

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis,EM)是指具有生長(zhǎng)功能的子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮腔被覆黏膜以外的身體其他部位。由于現(xiàn)代診療技術(shù)的不斷提高，EM的診斷率不斷上升。而在內(nèi)異癥中，異位內(nèi)膜病灶的生長(zhǎng)需要新的血管供應(yīng)，EGF是血管生長(zhǎng)因子家族中的一員，可以刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和體內(nèi)新生血管形成。而EGF受體(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)是表皮生長(zhǎng)因子(EGF)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的共同受體［15］。本研究采用免疫組化法定性檢測(cè)各組子宮內(nèi)膜異位大鼠的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的表達(dá)水平，探討異位寧對(duì)EGFR表達(dá)的影響。

1材料與方法

材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用Wistar雌性未孕大鼠，體重(200+20)g，鼠齡8～12周，購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，微生物控制等級(jí)為壹級(jí)。

實(shí)驗(yàn)藥物異位寧:由赤芍、柴胡、蓬莪術(shù)、延胡索、蜈蚣、黃芩、金銀花、薏苡仁、秦艽、牡蠣等中藥組成，購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，上藥共計(jì)200g，加水700mL，浸泡30min，頭煎武火40min，取汁200mL，二煎文火30min，取汁200min,二煎共得藥液400mL，文火濃縮至100mL，加95%乙醇200mL，置冰箱靜止24h離心(1600轉(zhuǎn)／min)，取上清液250mL，置水浴鍋提取乙醇，取藥液40min，相當(dāng)于每毫升含生藥5g，置于4℃冰箱內(nèi)備用。達(dá)那唑：100mg/粒，上海華聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：20040902。EGFR免疫組化染色試劑盒免疫組化常用輔助試劑：武漢博士德生物工程有限公司。

方法

造模方法雌性未孕Wistar大鼠，體重(200±20)g，皮下注射乙烯雌酚mg/只促情，以20％烏拉坦g／kg注射麻醉，待麻醉生效后，將大鼠固定操作臺(tái)上，腹部剪毛，碘伏消毒，在無(wú)菌條件下開(kāi)腹，約cm長(zhǎng)，右側(cè)離卵巢cm處分離子宮，結(jié)扎后在中間剪取約2cm一段子宮，剖開(kāi)子宮剝離子宮內(nèi)膜，將內(nèi)膜剪成3塊，分別縫于子宮分叉處、左側(cè)卵巢附近、左側(cè)腹膜壁層，關(guān)腹縫合。每鼠注射慶大霉素mL，連用3d，正常清潔飼養(yǎng)。

分組觀察正常飼養(yǎng)1個(gè)月后，隨機(jī)抽取10只造模大鼠2次開(kāi)腹。可見(jiàn)移植宮內(nèi)膜體積增大，部分增大物內(nèi)含液體物質(zhì)，部分增大物表面被結(jié)締組織包裹，大網(wǎng)、腸管、腹壁廣泛粘連。此后開(kāi)始灌胃給藥。正常對(duì)照組：每日灌服等容量蒸餾水。模型組：模型動(dòng)物術(shù)后1月開(kāi)始，每日灌胃等容量的生理鹽水。異位寧高劑量組：模型動(dòng)物術(shù)后1月開(kāi)始，每日以g/100g異位寧藥液灌胃。異位寧低劑量組：模型動(dòng)物術(shù)后1月開(kāi)始，每日以g/100g異位寧藥液給大鼠灌胃。西藥對(duì)照組：模型動(dòng)物術(shù)后1月開(kāi)始，每日以/100g達(dá)那唑混懸液給大鼠灌胃。均給藥4周后斷頭處死，剖取大鼠在位及異位子宮內(nèi)膜組織，分為3部分分別放入10%福爾馬林中供做免疫組化的石蠟切片。

實(shí)驗(yàn)方法EGFR采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)：(1)石蠟切片厚度5μm，裱于PolyLlysine處理過(guò)的載玻片上，置45℃溫箱拷片24h。(2)切片常規(guī)加水。(3)3%H2O2室溫10min，滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min。(4)熱修復(fù)抗原：將切片浸入M枸櫞酸鹽緩沖液，微波爐加熱，溫度保持在95℃，持續(xù)10min。取出容器，室溫冷卻20min，PBS洗滌。(5)滴加復(fù)合消化液，室溫5～10min，PBS洗滌2min／次，共3次。(6)滴加正常山羊血清封閉，室溫孵育10min。(7)傾去血清，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，置于濕盒內(nèi)37℃溫箱孵育60min，PBS洗滌，5min／次，共3次。(8)滴加生物素二抗，37℃溫箱孵育20min，PBS洗滌，5min／次，共3次。(9)滴加鏈霉親和素過(guò)氧化物酶，置于濕盒內(nèi)37℃溫箱孵育20min，PBS洗滌，5min／次，共3次。(10)DAB顯色，顯色10min，蒸餾水洗。(11)蘇木素輕復(fù)染，蒸餾水洗，樹(shù)脂膠固定，顯微鏡觀察。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。

2結(jié)果

各組大鼠局部組織EGFR表達(dá)結(jié)果比較：見(jiàn)表1。

表1各組大鼠局部組織EGFR表達(dá)結(jié)果

注：與模型組比較，#P＜，##P＜

3小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)探討EGFR在實(shí)驗(yàn)性大鼠在位與異位內(nèi)膜上的表達(dá)，及異位寧對(duì)EGFR表達(dá)的影響，免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型對(duì)照組EGFR的陽(yáng)性表達(dá)率偏高，與正常對(duì)照組比較有顯著差異(P＜)。在內(nèi)異癥中，異位內(nèi)膜病灶的生長(zhǎng)需要許多新的血管供應(yīng)，由此我們推測(cè)EGFR與EGF結(jié)合后，通過(guò)促有絲分裂的作用，促進(jìn)細(xì)胞增殖，進(jìn)而促進(jìn)異位子宮內(nèi)膜增生，而異位寧高劑量組中EGFR的陽(yáng)性表達(dá)率明顯偏低，與模型對(duì)照組相比有顯著差異(P＜)，表明異位寧可以抑制異位內(nèi)膜血管的形成，從而抑制異位子宮內(nèi)膜增生。

【參考文獻(xiàn)】

［1］OosterlynckD,etactivityofperitonealfluidfromwomenwithendometriosis［J］.FertilSteril,1993,59:778.

［2］Mc:arenJetconcentrationsareelevatedinperitonealfluidofwomenwithendomentriosis［J］.fromwomenwithendometriosisObstetGynecol,1994,83:287.

［3］RyanIP,et8concentrationsaredevatedinperitonealfluidofwomenwithendometriosis［J］.Fertilsteril,1995,63:929.

［4］Prenticegrowthfactorreceptorexpressioninnormalendometrium