抗菌藥物敏感試驗(yàn)細(xì)菌耐藥性檢測(cè)

關(guān)于抗菌藥物敏感試驗(yàn)細(xì)菌耐藥性檢測(cè)第1頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三2敏感和耐藥的概念

從本質(zhì)上講：細(xì)菌對(duì)某種抗菌藥物是敏感還是耐藥，常以該抗菌藥物的治療濃度與MIC的關(guān)系而定。常用劑量的抗菌藥物通過(guò)常用途徑所能達(dá)到的血藥濃度第2頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三3

血藥濃度與MIC之間的關(guān)系

敏感中介耐藥耐藥上限下限第3頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三4

抗菌藥物的治療濃度與MIC的關(guān)系：若MIC小于治療濃度，則為“敏感”（Sensitive,S），推薦使用。若MIC大于治療濃度，則為“耐藥”（Resistant,R）；若MIC介于治療濃度的上下限之間，則為“中度耐藥”（Intermediate,I）或中度敏感敏感和耐藥的概念

第4頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三5第5頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三6敏感治療濃度的上限

即表中的

R治療濃度的下限

即表中的S耐藥中介耐藥治療濃度CLSI標(biāo)準(zhǔn)MIC第6頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三7

第一節(jié)、抗菌藥物敏感性試驗(yàn)方法需氧和兼性厭氧菌第7頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三8稀釋法

?肉湯稀釋法（試管稀釋法）

?瓊脂稀釋法（平板稀釋法）紙片擴(kuò)散法（紙片法）E-試驗(yàn)聯(lián)合藥物敏感試驗(yàn)需氧和兼性厭氧菌藥敏試驗(yàn)的方法

第8頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三9稀釋法的特點(diǎn)定量的藥敏試驗(yàn)，測(cè)定MIC、MBC。方法比較繁瑣，手工操作一般不作為常規(guī)試驗(yàn)，常用于調(diào)查罕見耐藥。自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)采用微量稀釋法檢測(cè)MIC。第9頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三10二、紙片擴(kuò)散法（discdiffusiontest)

（Kirby-Bauer法）

原理：將浸有抗菌藥物的紙片貼在涂有測(cè)試菌的瓊脂平板上。抗菌藥物向瓊脂四周擴(kuò)散形成遞減的梯度濃度。藥物敏感細(xì)菌在紙片周圍一定距離內(nèi)的生長(zhǎng)受到抑制，形成抑菌圈。抑菌圈的大小反映測(cè)試菌對(duì)藥物的敏感程度。二者呈正相關(guān)。第10頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三11抑菌圈邊緣的藥物濃度與MIC第11頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三12

抑菌圈的大小與MIC：二者呈負(fù)相關(guān)，即抑菌圈愈大，MIC愈小。第12頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三13紙片法藥敏試驗(yàn)抑菌圈直徑與結(jié)果解釋的標(biāo)準(zhǔn)抗菌藥物與細(xì)菌

紙片含量

抑菌圈直徑：mm相應(yīng)MICμg/ml

耐藥中介度敏感耐藥敏感丁胺卡那霉素30μg≤1415-16≥17≥32≤16氨芐青霉素

測(cè)腸桿菌

10μg≤1112-13≥14≥32≤8

測(cè)葡萄球菌

10μg≤28—≥29

測(cè)嗜血桿菌

10μg≤19—≥20≥4≤0.25

測(cè)腸球菌

10μg≤16—≥16≤2第13頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三14

操作方法：1.制備M-H瓊脂平板，厚度4mm。2.制備0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡岫鹊木海ㄅ囵B(yǎng)16～24h，4~5個(gè)菌落）。3.菌液均勻涂布于平板。（15分鐘接種完畢）4.無(wú)菌貼標(biāo)準(zhǔn)抗生素紙片于M-H瓊脂表面，5.經(jīng)過(guò)35℃16～24h孵育。6.量取抑菌環(huán)直徑，根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)，報(bào)告細(xì)菌對(duì)該抗生素敏感、耐藥、中介。第14頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三15操作方法：1.將在約56℃恒溫的無(wú)菌M-H瓊脂傾注直徑為90mm

的平板，其厚度

4mm。第15頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三162.無(wú)菌挑取孵育16～24h的血平板上4~5個(gè)菌落。第16頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三173.將菌置于無(wú)菌生理鹽水中，校正其濁度于0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡岫鹊木骸?.5×108CFU/ml第17頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三184.用無(wú)菌棉簽浸入細(xì)菌懸液中，將拭子在試管上壁輕輕擠壓以擠去過(guò)多的菌液。棉簽在三個(gè)方向均勻抹瓊脂表面（每次轉(zhuǎn)60℃）使菌液均勻分布，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周。第18頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三195.蓋上平板的蓋子，放置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，放置3~10分鐘后貼上標(biāo)準(zhǔn)抗生素紙片。第19頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三206.用無(wú)菌鑷子或紙片分配器將抗菌紙片粘貼于M-H瓊脂的表面，一旦紙片貼上，不能移動(dòng)；各抗菌紙片中心距離應(yīng)大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15mm。第20頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三217.經(jīng)過(guò)35℃16～24h孵育。8.取抑菌環(huán)直徑，根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)，報(bào)告細(xì)菌對(duì)該抗生素敏感、耐藥、中介。第21頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三22紙片擴(kuò)散法質(zhì)量控制

培養(yǎng)基：M-H平板厚度，4mm細(xì)菌懸液：0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌濃度藥敏紙片的質(zhì)量各抗菌紙片中心距離應(yīng)大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15mm。

9cm的平板貼6個(gè)培養(yǎng)時(shí)間質(zhì)控菌株↗↗↘↗抑菌圈直徑？↘↘↗第22頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三23第23頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三24根據(jù)抑菌圈的直徑，依照CLSI標(biāo)準(zhǔn)，作出敏感、耐藥、和中介的判斷。為‘‘定性”結(jié)果。CLSI推薦的最簡(jiǎn)單的藥敏試驗(yàn)。紙片擴(kuò)散法的特點(diǎn)第24頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三25三、E試驗(yàn)法（濃度梯度法）

原理：E試條是一條5mm×50mm無(wú)孔試劑載體，一面固定有一系列預(yù)先制備的濃度呈連續(xù)指數(shù)增長(zhǎng)的抗菌藥物，另一面有判別的刻度。抗菌藥物的梯度可覆蓋有15--20個(gè)對(duì)倍稀釋濃度的寬度范圍。將E試條放在細(xì)菌接種過(guò)的瓊脂平板上，經(jīng)孵育，圍繞試條明顯可見橢圓形抑菌圈，圈的邊緣與試條交點(diǎn)的刻度濃度即為抗菌藥物抑制細(xì)菌的MIC。依照CLSI標(biāo)準(zhǔn)判斷其敏感、耐藥、中介。

2561288016第25頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三26無(wú)菌生長(zhǎng)區(qū)有菌生長(zhǎng)區(qū)第26頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三27

橢圓形細(xì)菌生長(zhǎng)抑制區(qū)2561288016判讀抑菌濃度（MICug/ml)第27頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三28第28頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三29第29頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三30Etest法特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)連續(xù)濃度梯度，與瓊脂稀釋法相關(guān)性好（相關(guān)系數(shù)為0.9）.可測(cè)MIC。操作簡(jiǎn)單，影響因素少，穩(wěn)定性高。缺點(diǎn)：E試條較昂貴;

不適用于生長(zhǎng)緩慢的苛養(yǎng)菌。第30頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三31用于病原菌尚未確定的急、重癥感染的經(jīng)驗(yàn)治療,以擴(kuò)大病原治療的覆蓋面治療多種細(xì)菌所引起的混合感染對(duì)于某些耐藥菌可取得協(xié)同抗菌作用減少或推遲治療過(guò)程中細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生避免藥物達(dá)到毒性劑量。四、聯(lián)合藥物敏感試驗(yàn)聯(lián)合藥物意義第31頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三32增強(qiáng)作用：兩種抗生素聯(lián)用的效果大于它們單獨(dú)使用時(shí)的效果之和；20％～25％相加作用：它們聯(lián)用時(shí)的效果等于單用兩種抗生素效果之和；60％～70％無(wú)關(guān)作用：兩種抗生素聯(lián)用的效果，僅相當(dāng)于其中一種具有較強(qiáng)作用的抗生素的效果；拮抗作用：兩種抗生素聯(lián)用時(shí)的效果反而小于它們分別使用時(shí)的效果之和。

10％～15％兩種藥物的聯(lián)合使用的效果第32頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三33

兩種抗菌藥物作用部位不同：β－內(nèi)酰胺類抗生素（抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成）與氨基糖苷類抗生素（干擾細(xì)菌的代謝）。增強(qiáng)作用：增加了藥物進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞桿菌肽（降低細(xì)胞通透性）與氨基糖苷類藥物（干擾細(xì)菌的代謝）。拮抗作用：降低了藥物進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞抗菌藥物協(xié)同作用發(fā)生原理第33頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三34棋盤稀釋法

利用肉湯稀釋法原理，依據(jù)兩種藥物的MIC，以棋盤設(shè)計(jì)兩種藥物不同濃度的組合。計(jì)算抑菌濃度指數(shù)（fractioninhaibitoryconcentration,FIC)聯(lián)合藥物敏感試驗(yàn)方法第34頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三35棋盤稀釋法首先分別測(cè)定擬聯(lián)合的抗菌藥物對(duì)檢測(cè)菌的MIC。藥物最高濃度為MIC的2倍，對(duì)倍稀釋。兩種藥物的稀釋分別在方陣的縱列和橫列進(jìn)行，這樣在每管（孔）中可得到不同濃度組合的兩種藥物混合液。接種菌量為5×105CUF／ml，35℃孵育18h后觀察結(jié)果。計(jì)算部分抑菌濃度（FIC）指數(shù)。第35頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三36抑菌濃度指數(shù)（FIC）FIC＝A藥聯(lián)合時(shí)的MICA藥單測(cè)的MICB藥聯(lián)合時(shí)的MICB藥單測(cè)的MIC＋FIC﹤0.5為協(xié)同作用；0.5～1為相加作用；

1～2為無(wú)關(guān)作用；﹥2為拮抗作用第36頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三37A藥：321684B藥:16

8

42生長(zhǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng)

生長(zhǎng)第37頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三38藥敏試驗(yàn)方法的比較K-B法：

WTO推薦使用的最簡(jiǎn)單的定性藥敏試驗(yàn)。稀釋法：準(zhǔn)確測(cè)定MIC、MBC，比較繁瑣，試管法一般不作為常規(guī)試驗(yàn)。

微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)采用微量稀釋法原理。E試驗(yàn)：可測(cè)定MIC。第38頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三39第二節(jié)結(jié)核分枝桿菌的藥敏試驗(yàn)

（了解）首次分離的分枝桿菌需做藥敏試驗(yàn)，有助于合理用藥和監(jiān)測(cè)藥物敏感性。另外經(jīng)過(guò)三個(gè)月正規(guī)治療，標(biāo)本分離培養(yǎng)仍為陽(yáng)性患者，或感染的嚴(yán)重疾患（如播散性結(jié)核病和結(jié)核性腦膜炎）。以及來(lái)自高耐藥流行區(qū)的患者，均須做體外藥敏試驗(yàn)。第39頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三40四種方法比例法放射同位素法絕對(duì)濃度法耐藥率法直接法：直接采用圖片陽(yáng)性的體液標(biāo)本。（須經(jīng)充分消化五雜菌）間接法：經(jīng)分離純培養(yǎng)后的次代培養(yǎng)菌。第40頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三41無(wú)藥藥2藥3藥1Middlebrook7H10瓊脂培養(yǎng)3周間接比例法（WHO推薦）敏感：含藥格無(wú)結(jié)核桿菌生長(zhǎng)，或菌落數(shù)﹤1%對(duì)照格耐藥：含藥格菌落數(shù)≧1%對(duì)照格。不含藥的對(duì)照格菌落數(shù)應(yīng)為50~1504格平板第41頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三42分枝桿菌微量直視快速藥敏試驗(yàn)法4000倍第42頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三43培養(yǎng)72h觀察結(jié)果INH敏感RFP耐藥陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照第43頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三44第三節(jié)厭氧菌體外藥敏試驗(yàn)

（了解）厭氧菌感染多為內(nèi)源性感染，厭氧菌藥物敏感性穩(wěn)定，一般不做體外藥敏試驗(yàn)。下述情況應(yīng)考慮藥敏試驗(yàn)：明確厭氧菌引起的嚴(yán)重感染；已確證的厭氧菌感染，經(jīng)驗(yàn)性選藥治療未能奏效；需長(zhǎng)期用藥的厭氧菌感染。第44頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三45基本原理和方法與需氧菌相同，只是在培養(yǎng)基、操作環(huán)境和培養(yǎng)條件等應(yīng)根據(jù)厭氧菌的特定需要變動(dòng)。培養(yǎng)基為布氏血瓊脂再加人補(bǔ)充劑5μg/ml氯化血紅素，5％脫纖維羊,1μg/mlVitK。厭氧孵育條件質(zhì)控菌株為脆弱類桿菌ATCC25285。厭氧菌體外藥敏試驗(yàn)第45頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三46藥敏試驗(yàn)結(jié)果的臨床價(jià)值

影響抗菌藥物臨床療效的因素很多，據(jù)報(bào)道藥敏試驗(yàn)結(jié)果與臨床療效的符合率約為70%

，因此細(xì)菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)報(bào)告只能作為臨床用藥的參考，應(yīng)根據(jù)患者用藥后的治療反應(yīng)和臨床病情及時(shí)調(diào)整用藥。醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的靈魂是與臨床溝通。第46頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三47新的藥敏試驗(yàn)方法探索流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抗生素最低抑菌濃度分枝桿菌藥物最低抑菌濃度的快速測(cè)定方法研究第47頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三48細(xì)菌耐藥性的發(fā)生過(guò)程：細(xì)菌獲得與耐藥相關(guān)的基因編碼與耐藥有關(guān)的蛋白表現(xiàn)出對(duì)某種抗生素的耐藥基因：537表型：書533頁(yè)敏感性第48頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三49第35章第三節(jié)

細(xì)菌耐藥性檢測(cè)第49頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三50生物化學(xué)技術(shù)檢測(cè)酶的等電點(diǎn)(等電聚焦電泳)頭孢哨噻吩濾紙片法碘淀粉測(cè)定法分析酶的底物譜及抑制物譜紙片法和稀釋法1、β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)臨床意義：產(chǎn)ESBL克雷伯菌和大腸埃希菌對(duì)青霉素、頭孢菌素和氨曲南治療無(wú)效。一、耐藥表型檢測(cè)第50頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三51G-菌產(chǎn)生的頭孢菌素酶檢測(cè)

-----頭孢哨噻吩濾紙片法

用接種環(huán)挑取受試菌于頭孢哨噻吩（產(chǎn)色頭孢菌素）濾紙片上(商品化)，10分鐘內(nèi)由淺黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色即陽(yáng)性結(jié)果，表示頭孢菌素的β-內(nèi)酰胺環(huán)被酶打開。臨床意義：產(chǎn)生該酶的細(xì)菌對(duì)頭孢菌素類抗生素耐藥。第51頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三52G+菌產(chǎn)生的青霉素酶檢測(cè)

-----碘淀粉測(cè)定法

受試菌混于青霉素溶液，振搖30分鐘。加入淀粉液后，再加入碘液，溶液變藍(lán)，繼續(xù)振搖。10分鐘之內(nèi)藍(lán)色消失者為產(chǎn)酶株。青霉素酶青霉素青霉素噻唑酸碘碘淀粉復(fù)合物變?yōu)闊o(wú)色

多為金黃色葡萄球菌產(chǎn)生，對(duì)青霉素G耐藥。第52頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三53超廣譜β-內(nèi)酰胺酶

Extended-Spectyumβ-Lactamase，ESBL

ESBLs能水解青霉素類，頭孢菌素和氨曲南。不能水解碳青烯酶類，如亞胺培南多數(shù)可被β內(nèi)酰胺酶抑制劑（如克拉維酸，三唑巴坦及舒巴坦）所抑制。如為ESBL陽(yáng)性，則對(duì)青霉素類，頭孢菌素和氨曲南均報(bào)告耐藥，不考慮體外藥敏結(jié)果。第53頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三54常見產(chǎn)ESBLs菌株最常見是腸桿菌科細(xì)菌（大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌）；其次，陰溝腸桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、弗勞地枸櫞酸菌、銅綠假單胞菌、奈瑟菌等。

第54頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三55ESBLs的臨床意義對(duì)產(chǎn)ESBLs菌株，目前最有效的抗生素為碳青霉烯類（泰能），其次，頭孢西丁及含酶抑制劑的復(fù)合劑、氨基糖甙類部分有效。若臨床出現(xiàn)產(chǎn)ESBLs菌株，會(huì)在病人和醫(yī)院之間及不同菌株間相互傳播，應(yīng)引起充分的重視。第55頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三56紙片初篩：培養(yǎng)基：Muller-Hinton瓊脂藥敏紙片接種：按標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法孵育：35℃大氣環(huán)境，16-18小時(shí)結(jié)果：頭孢泊肟（10ug／片）抑菌環(huán)≤22mm

頭孢他啶（10ug／片）抑菌環(huán)≤22mm

氨曲南（30ug／片）抑菌環(huán)≤27mm

頭孢噻肟（30ug／片）抑菌環(huán)≤27mm

頭孢曲松（30ug／片）抑菌環(huán)≤25mm

超β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)紙片擴(kuò)散法ESBLs的底物可能產(chǎn)生ESBLs第56頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三57

培養(yǎng)基：Muller-Hinton瓊脂藥敏紙片濃度：頭孢噻肟30ug、頭孢噻肟/克拉維酸30ug/10ug

頭孢他啶30ug、頭孢他啶/克拉維酸30ug/10ug接種：按標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法孵育：35℃大氣環(huán)境，16-18小時(shí)結(jié)果：復(fù)合制劑藥物紙片的抑菌圈直徑比非復(fù)合制劑藥物紙片的直徑

≧5mm

以上者為產(chǎn)ESBLs菌。ESBLs的底物ESBLs的抑制劑(1)．紙片確證試驗(yàn)：第57頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三58混合克拉維酸藥物紙片無(wú)克拉維酸藥物紙片的直徑直徑差﹥5mm：ESBL第58頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三59

篩選試驗(yàn)：選用頭孢泊肟、頭孢他啶、氨曲南、頭孢噻肟或頭孢曲松至少2種以上，用標(biāo)準(zhǔn)肉湯稀釋法稀釋至1μg/ml,凡被測(cè)菌在上述各管中能夠生長(zhǎng)(MIC≥2μg/ml)，高度懷疑為ESBLs，應(yīng)進(jìn)一步作確認(rèn)試驗(yàn)來(lái)加以確診。（2）液體稀釋法第59頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三60

確認(rèn)試驗(yàn)：用標(biāo)準(zhǔn)肉湯稀釋法測(cè)定MIC的方法,頭孢噻肟單獨(dú)稀釋(0.25～64μg/ml)及頭孢噻肟(稀釋范圍相同)加克拉維酸(每管4μg/ml);

頭孢他啶單獨(dú)稀釋(0.25～128μg/ml)及頭孢他啶加克拉維酸(每管4μg/ml),

上述2種藥物必須同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果加克拉維酸和不加克拉維酸的

MIC差值≥8倍(3個(gè)稀釋度)，可確認(rèn)為ESBLs菌株。（2）液體稀釋法第60頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三61二、細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)基因檢測(cè)方法檢測(cè)細(xì)菌耐藥性的優(yōu)缺點(diǎn)抗生素耐藥性的基因檢測(cè)方法基因檢測(cè)方法的應(yīng)用第61頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三62基因檢測(cè)細(xì)菌耐藥性的優(yōu)點(diǎn)：能早期指導(dǎo)臨床醫(yī)生治療用藥。分子遺傳學(xué)方法可以直接從臨床標(biāo)本入手，無(wú)需菌株的培養(yǎng)，極大地節(jié)省時(shí)間，減輕實(shí)驗(yàn)室生物危險(xiǎn)性。有助鑒別那些處于中介水平或常規(guī)藥敏結(jié)果模棱兩可的結(jié)果。分子生物學(xué)方法被認(rèn)為是“金標(biāo)準(zhǔn)”。在細(xì)菌耐藥性的流行病追蹤調(diào)研中，耐藥基因檢測(cè)比抗生素敏感方法更準(zhǔn)確。發(fā)現(xiàn)新的耐藥基因。第62頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三63基因檢測(cè)方法檢測(cè)抗生素耐藥性的缺點(diǎn)：當(dāng)樣品中菌量很少時(shí)，其敏感性會(huì)大大降低。對(duì)每一個(gè)測(cè)試的抗菌藥物，均需要設(shè)計(jì)相應(yīng)的分子檢測(cè)方法，一次只能檢測(cè)一種耐藥機(jī)制。目前仍有許多耐藥機(jī)制是未知的，無(wú)法進(jìn)行分子檢測(cè)。耐藥基因的檢測(cè)也會(huì)存在假陽(yáng)性問(wèn)題。對(duì)許多耐藥基因的檢測(cè)方法，目前還缺乏臨床對(duì)照研究以評(píng)價(jià)其準(zhǔn)確性、重復(fù)性及臨床應(yīng)用價(jià)值。第63頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三64常見的細(xì)菌耐藥相關(guān)基因舉例基因耐藥抗生素細(xì)菌種類基因大小bpAnt(4’）氨基糖苷類金黃色葡萄球菌473ant（6’)-la氨基糖苷類糞腸球菌470mecAβ－內(nèi)酰胺類金黃色葡萄球菌400blaTEMβ一內(nèi)酰胺類大腸埃希菌424catD氯霉素艱難桿菌270第64頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三65耐藥基因檢測(cè)方法：分子方法檢測(cè)耐藥基因的基礎(chǔ)是PCR。在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展的方法：分子雜交、DNA序列分析，基因微振列技術(shù)等。

第65頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三66PCR-序列特異性引物擴(kuò)增耐藥基因標(biāo)本提取DNAPCR擴(kuò)增目的基因DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析12341234耐藥基因的的特異性引物理想的靶序列應(yīng)當(dāng)是耐藥基因的編碼區(qū)域，而非編碼區(qū)外的基因(如插入序列或啟動(dòng)子序列)。特異性高，需要設(shè)立陰性對(duì)照。第66頁(yè)，講稿共75頁(yè)，2023年5月2日，星期三67基因芯片技術(shù)芯片制備：以玻璃片或硅片為載體，采用原位合成和微矩陣的方法將寡核苷酸片段或cDNA作為探針按順序排列在載體上。樣品制備：生物樣品往往是復(fù)雜的生物分子混合體，須將樣品進(jìn)行提取、擴(kuò)增，獲取其中的蛋白質(zhì)或D