1-25羥化維生素D3對人高轉移巨細胞肺癌PGCL3細胞侵襲、遷移和粘附能力的影響

1，25羥化維生素D3對人高轉移巨細胞肺癌PGCL3細胞侵襲、遷移和粘附能力的影響

【摘要】目的探討1，25羥化維生素D3對人高轉移巨細胞肺癌PGCL3細胞粘附、侵襲和遷移能力的影響。方法MTT法檢測其對PGCL3細胞生長的影響；分別用粘附相關基底膜成分分析實驗、重組基底膜侵襲實驗、Transwell室趨化運動模型研究骨化三醇對PGCL3細胞的粘附、侵襲和運動能力的影響。結果骨化三醇明顯抑制PGCL3細胞的生長。骨化三醇作用PGCL3細胞24h的IC50值為μmol/L。骨化三醇、、μmol/L處理PGCL3細胞24h，對PGCL3細胞侵襲能力的抑制率分別為%、%、%，對PGCL3細胞運動能力的抑制率分別為%、%、%。降低PGCL3細胞對層粘連蛋白、纖維粘連蛋白的粘附率，且其效果呈一定的劑量依賴關系。結論骨化三醇抑制人高轉移巨細胞肺癌PGCL3細胞的粘附、侵襲和遷移能力；骨化三醇對PGCL3細胞粘附和侵襲的影響與其降低PGCL3細胞對層粘連蛋白、纖維粘連蛋白的粘附率有關。

【關鍵詞】1，25羥化維生素D3；粘附；侵襲;遷移；人高轉移巨細胞肺癌PGCL3細胞

【Abstract】ObjectiveThisstudywasdesignedtoinvestigatetheeffectsof1，25-dihydroxyvitaminD3onadhesion，invasionandmigrationofPGCL3CellgrowinhibitionwasmeasuredbyMTTassay.Theeffectsof1，252vitD3onadhesion、invasionandmigrationofPGCL3cellsweredeterminedusinganalysisofadhesion-relatedbasementmembranecomponentsfibronectinandlaminin，reconstitutedbasementmembraneinvasionassay，andTranswellmodel，1，252vitD3displayedgrowthinhibitoryactivityagainstPGCL3cellswithIC50valuesofμmol/Lfor24hoursoftreatment.，andμmol/Lof1，25-dihydroxyvitaminD3inhibitedPGCL3cellstoinvadethereconstitutedbasementmembraneby%，%，%，anddecreasedthepercentagesoflocomotionandmigrationofPGCL3cellsby%，%，%.Inaddition，1，25-dihydroxyvitaminD3inhibitedPGCL3cellstoadheretothebasementmembranecomponentsfibronectinand1，25-dihydroxyvitaminD3cansignificantlyinhibittheadhesion，invasionandmigrationofPGCL3cells，andthesuppressionofadhesionofPGCL3cellstofibronectinandlamininmayberesponsiblefortheinhibitionofadhesionandinvasionofPGCL3cells.

【Keywords】1，25-dihydroxyvitaminD3;adhesion;invasion;migration;PGCL3cells

侵襲和轉移是不斷改進性腫瘤最重要的惡性行為和治療的主要障礙，是臨床90%以上癌癥患者的致死因素，因此，控制侵襲和轉移成為惡性腫瘤患者預后的關鍵因素，研發(fā)具有抗腫瘤轉移的新藥有著十分重要的意義。

1，25羥化維生素D3又名骨化三醇，是維生素D在肝臟和腎臟羥化酶的作用下最終被轉化為其活性形式。近幾年來其對腫瘤細胞的影響備受關注。骨化三醇對體外培養(yǎng)的幾乎所有類型的腫瘤細胞有抑制或促分化作用，并且能夠抑制、殺死或預防體內多種腫瘤［1～5］。但其對腫瘤的作用機制尚未完全明確，最近的研究結果表明骨化三醇的抗腫瘤作用與其抑制

腫瘤細胞轉移、侵襲和血管生成相關。目前，骨化三醇對人高轉移巨細胞肺癌PGCL3細胞轉移能力的影響還未見報道。本文對骨化三醇對人PGCL3細胞生長增殖、侵襲、運動和粘附能力的影響進行研究，為將其開發(fā)成為有效的臨床抗腫瘤轉移藥提供理論依據(jù)。

1材料與方法

材料與試劑1，252VitD3、MTT、纖維粘連蛋白、蘇木精、伊紅、優(yōu)凱特均購自Sigma公司；超級無支原體新生牛血清購自杭州四季青生物材料有限公司；RPMI-1640購自美國Hyclone公司；層粘連蛋白購自北京大學醫(yī)學部病理系；胰酶購自美國Gibco公司；Transwell室購自美國Costar公司；聚碳酸酯膜購自美國Millipore公司；膠原購自華美生物工程公司。其余試劑均為國產分析純。人高轉移巨細胞肺癌PGCL3細胞引自北京大學醫(yī)學部病理系。

方法

細胞培養(yǎng)PGCL3細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清，100ku/L青霉素和100mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

MTT法檢測骨化三醇對PGCL3細胞生長的影響取對數(shù)生長期細胞，接種于96孔板，每孔接種100μl。培養(yǎng)過夜后，吸出培養(yǎng)液，加入新培養(yǎng)液90μl，及不同濃度的骨化三醇溶液10μl，使終濃度分別為、、、μmol/L。對照組則加入相同體積的培養(yǎng)液，每一濃度設8個平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h。每孔加入MTT20μl，培養(yǎng)4～6h。每孔加入三聯(lián)液DMSO100μl。用ELX800型酶標儀在570nm波長處測量OD值，以Bliss法計算半數(shù)抑制濃度。

細胞侵襲實驗Transwell室朝上室方向的上膜面已鋪好Matrigel，朝下室方向的下膜面涂纖維粘連蛋白10μl，風干后放入已含有600μl含%牛血清白蛋白的RPMI-1640培養(yǎng)液的下小室中，37℃孵育1h，取出備用。將經、、μmol/L骨化三醇處理24h的PGCL3細胞重懸于含%BSA的RPMI-1640培養(yǎng)液中，調整細胞濃度為×109個/L，加100μl細胞懸液于Transwell室的上小室。對照組為未經骨化三醇處理的PGCL3細胞，每組設3個平行孔。在細胞培養(yǎng)箱孵育6h。取出上小室，甲醇固定3min，蘇木精染色3min，水洗。伊紅染色10s，水洗。擦去上膜面的Matrigel及未穿過膜的細胞，優(yōu)凱特膠封片。在400倍光學顯微鏡下隨機選擇6個視野，計數(shù)每個視野穿過膜的細胞數(shù)。計算平均值，以穿過膜的細胞相對數(shù)目來表示腫瘤細胞的侵襲能力。侵襲抑制率=×100%。

細胞運動實驗除膜上不涂纖維粘連蛋白外，其余方法步驟同。

細胞與FN、LN的粘附實驗分別將μgFN、LN鋪于96孔板。用50μl含2%BSA的RPMI-1640培養(yǎng)液封閉1h，PBS洗2次，待用。將經、、μmol/L骨化三醇處理24h的PGCL3細胞重懸于含%BSA的無血清RPMI-1640培養(yǎng)液中，調整細胞濃度為8×108個/L，每孔加100μl細胞懸液，對照組為未經骨化三醇處理過的PGCL3細胞，每一濃度設8個平行孔。37℃孵育1h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入200μl預熱的PBS洗去未粘附細胞。每孔加入100μlMTT，調零孔無細胞，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h后，每孔加入100μlDMSO，用ELX800型酶標儀在570nm波長處測量OD值，細胞粘附率按下式計算。細胞粘附率=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，結果用Student′sttest進行統(tǒng)計分析。

2結果

骨化三醇對人高轉移巨細胞肺癌PGCL3生長的抑制作用結果表明，骨化三醇可明顯抑制PGCL3細胞的生長。骨化三醇作用PGCL3細胞24h的IC50為μmol/L。表1不同濃度骨三醇對PGCL3的生長抑制作用

注：與對照組比較，***P＜

骨化三醇對PGCL3細胞侵襲能力的影響經骨化三醇、、μmol/L作用24h后，PGCL3細胞侵襲重組基底膜的能力明顯受到抑制，抑制率分別為%、%、%。表2骨化三醇對PGCL3細胞侵襲能力的影響

注：與對照組比較，*P

骨化三醇對PGCL3細胞運動能力的影響骨化三醇、、μmol/L作用PGCL3細胞24h后，能抑制PGCL3細胞的運動能力，且呈劑量依賴性，抑制率分別為%、%、%。表3骨化三醇對PGCL3細胞運動能力的影響

注：與對照組比較，*P

骨化三醇對PGCL3細胞與FN、LN粘附能力的影響見圖1。

圖1骨化三醇對PGCL3細胞FN、LN粘附能力的影響

由圖1看出、、μmol/L的骨化三醇作用PGCL3細胞24h后能降低PGCL3細胞對基質成分LN、FN的粘附率，并呈一定的劑量依賴關系。

3討論

本實驗結果表明骨化三醇能明顯抑制PGCL3細胞生長，作用PGCL3細胞24h后的IC50為μmol/L。而抗腫瘤侵襲、運動和粘附能力的藥物其對腫瘤細胞的細胞毒作用應控制在10%左右，因此，選擇、、μmol/L骨化三醇來進行實驗。這三個濃度的骨化三醇對PGCL3細胞的生長無明顯影響，但經實驗表明可降低PGCL3細胞的侵襲能力，這說明骨化三醇抑制PGCL3細胞侵襲、粘附和遷移可能與其細胞毒作用無直接關系。

近年來，腫瘤的侵襲轉移機制的研究在細胞和分子水平上已取得了一不定期的進展。Liotta等提出侵襲過程分為“三步”：粘附、降解基底膜和基質運動。上述三步重復進行，使得腫瘤細胞向深層侵襲。μmol/L骨化三醇即可明顯抑制PGCL3細胞侵襲能力和細胞趨向性運動能力，并能降低PGCL3細胞與細胞外基質成分FN、LN的粘附。因此，上述幾項實驗結果說明骨化三醇是通過抑制細胞粘附、運動而抑制PGCL3細胞的體外侵襲能力的?！緟⒖嘉墨I】

1PourgholamiMH，AkhterJ，LuY，etal.Invitroandinvivoinhibitionoflivercancercellsby1，25-dihydroxyvitaminD3.CancerLett，2000，151:97-102.

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4GrossC，StasmeyT，HancockS，etal.Treatmentofearlyre