用于基因克隆的載體

關(guān)于用于基因克隆的載體第1頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三第二章分子克隆單元操作2.2

2.3

2.1

用于基因克隆的載體DNA的體外重組（切與接）目的基因的克隆2.4

轉(zhuǎn)化與擴(kuò)增（轉(zhuǎn)與增）轉(zhuǎn)化子的篩選與重組子的鑒定（檢）2.5

第2頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三基因工程基本流程第3頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三2.1用于基因克隆的載體質(zhì)粒載體噬菌體或病毒載體考斯質(zhì)粒與噬菌粒人工染色體載體載體的基本概念第4頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三一、載體的基本概念載體（Vector）：是把外源DNA（目的基因）導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使之傳代、擴(kuò)增或表達(dá)的工具。載體的主要功能：運(yùn)載：高效運(yùn)載外源基因至受體細(xì)胞內(nèi)維持：自主復(fù)制或整合至宿主基因組，以達(dá)傳代目的擴(kuò)增：使外源基因拷貝數(shù)增加（克隆載體）表達(dá)：為目的基因表達(dá)提供順式元件（表達(dá)載體）第5頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三2、載體應(yīng)具備的條件可轉(zhuǎn)移性：具有針對(duì)受體細(xì)胞的“親緣性”或“親和性”

可篩選性：具有合適的篩選標(biāo)記

具有一定的裝載能力：在插入外源基因后仍能有效轉(zhuǎn)化宿主基因文庫構(gòu)建需要非常大的容量方便外源基因克隆：具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn)

(或多克隆位點(diǎn))可傳代性：具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)

第6頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三第7頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三3、載體類型克隆載體（cloningvector）主要用于在大腸桿菌細(xì)胞中克隆目的基因，或在大腸桿菌或釀酒酵母細(xì)胞中構(gòu)建基因文庫。表達(dá)載體（expressionvector)除含基因克隆所需元件外，還有供外源基因表達(dá)用的啟動(dòng)子、終止子等順式元件，用于在特定的宿主中表達(dá)目的基因。1）按功能分主要有：第8頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三3、載體類型自主復(fù)制型載體含復(fù)制子，可獨(dú)立于宿主染色體外復(fù)制與傳代。

穿梭載體裝有針對(duì)兩種不同受體的復(fù)制起點(diǎn)，便于基因克隆整合型載體不含復(fù)制子，需借助同源重組機(jī)制整合于宿主基因組。2）按傳代特性分：第9頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三早期發(fā)現(xiàn)的大腸桿菌-枯草桿菌穿梭質(zhì)粒載體大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體大腸桿菌-牛乳頭瘤病毒迄今還沒有發(fā)展出適用的大腸桿菌-植物細(xì)胞穿梭載體。第10頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三第11頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三3、載體類型質(zhì)粒（Plasmid)噬菌體（bacteriophage)/病毒(virus)考斯質(zhì)粒（cosmid）噬菌粒（phagemid）人工染色體（YAC，BAC）3）按來源分：第12頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三二、質(zhì)粒(plasmid)質(zhì)粒的生物學(xué)特性質(zhì)粒載體的特點(diǎn)與類型幾個(gè)重要的質(zhì)粒載體質(zhì)粒的制備與鑒定天然質(zhì)粒質(zhì)粒載體的穩(wěn)定性問題第13頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三（一）質(zhì)粒的生物學(xué)特性質(zhì)粒：是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于宿主染色體而自主復(fù)制、并能穩(wěn)定遺傳的一類DNA分子。*質(zhì)粒常見于原核細(xì)菌和真菌中*絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒具有共價(jià)、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即cccDNA（covalentlyclosedcircularDNA)*質(zhì)粒DNA的分子量范圍：1-200kb大腸桿菌的質(zhì)粒主要有F質(zhì)粒（F因子）、R質(zhì)粒（抗藥性因子）和Col質(zhì)粒（大腸桿菌素因子）第14頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三1、質(zhì)粒的自主復(fù)制性質(zhì)粒是獨(dú)立的復(fù)制子（replicon）：含復(fù)制起始位點(diǎn)（origin,ori)和控制復(fù)制頻率的調(diào)控基因

能利用宿主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制(ori)為與宿主穩(wěn)定地共存并把代謝負(fù)擔(dān)減至最低,質(zhì)粒必須控制自身的復(fù)制。在一定的生長(zhǎng)條件下、在一定的宿主菌中,某一質(zhì)粒的拷貝數(shù)通常是一定的。第15頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三DNA的復(fù)制是由固定的起始點(diǎn)開始的。一般把生物體的復(fù)制單位稱為復(fù)制子（replicon）。一個(gè)復(fù)制子只含一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。細(xì)菌、病毒和線粒體的DNA分子都是作為單個(gè)復(fù)制子完成復(fù)制的，而真核生物基因組可以同時(shí)在多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)上進(jìn)行雙向復(fù)制，也就是說它們的基因組包含有多個(gè)復(fù)制子。第16頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三質(zhì)粒的復(fù)制調(diào)控：調(diào)控區(qū)緊鄰ori，方便構(gòu)建調(diào)控區(qū)編碼RNAI（反義）和Rop蛋白，抑制復(fù)制引物RNAII與模板結(jié)合oriE.coliColE1

plasmid復(fù)制方向rop（+）RopRNAII（引物）RNAI3’5’5’3’63個(gè)氨基酸,提高RNAI的抑制缺失會(huì)如何？第17頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三調(diào)控區(qū)編碼抑制蛋白Cop，控制復(fù)制起始因子與復(fù)制起始位點(diǎn)（ori）的結(jié)合PcopcopP/OrepreporiCopRep起始因子抑制蛋白質(zhì)如何通過質(zhì)粒改造提高質(zhì)粒的拷貝數(shù)？第18頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三根據(jù)質(zhì)粒復(fù)制調(diào)控的嚴(yán)密程度，質(zhì)?？煞譃閮纱髲?fù)制類型：嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒：1-5拷貝，如pSC101松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒：30-50拷貝，如ColE1氯霉素?cái)U(kuò)增：在宿主菌生長(zhǎng)的中后期，通過添加氯霉素抑制蛋白質(zhì)合成、關(guān)閉主要代謝途徑，以使松弛型質(zhì)粒迅速大量擴(kuò)增（可達(dá)上千拷貝）的操作。第19頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三2、質(zhì)粒的不相容性質(zhì)粒的不相容性：在沒有選擇壓力的情況下，任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞中的現(xiàn)象。不相容性的質(zhì)粒組成不相容性群以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：ColE1、pMB1擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容pSC101、F、RP4擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容第20頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三質(zhì)粒的不相容性的分子機(jī)制兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，可導(dǎo)致子代細(xì)胞質(zhì)粒組成不同，且這種差異具隨機(jī)性，經(jīng)過若干代后宿主細(xì)胞中處于數(shù)量弱勢(shì)的質(zhì)粒必然被淘汰，而僅剩強(qiáng)勢(shì)質(zhì)粒。第21頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三第22頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三3、質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢悾航雍闲唾|(zhì)粒能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞（接合作用），如F、部分Col、R質(zhì)粒等如Col、R的其它成員非接合型質(zhì)粒不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個(gè)過程由bom和mob基因決定第23頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三第24頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三4、攜帶特殊的遺傳標(biāo)記野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記基因，這使得宿主生物產(chǎn)生正常生長(zhǎng)非必需的附加性狀，包括：物質(zhì)抗性

抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物物質(zhì)合成

細(xì)菌毒素、有機(jī)堿這些標(biāo)記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義第25頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三天然質(zhì)粒的改造野生型質(zhì)粒的缺點(diǎn)：

分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想改造策略：去掉復(fù)制和維持非必須序列；失活復(fù)制負(fù)調(diào)控序列；引入多克隆位點(diǎn)；引入理想的篩選標(biāo)記基因pSC1018.8kb拷貝數(shù)5四環(huán)素抗性標(biāo)記基因TcrColE16.5kb拷貝數(shù)20-30大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因E1RSF2124ColE1衍生質(zhì)粒氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因Apr野生質(zhì)粒第26頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三選擇性標(biāo)記：供重組子篩選用的遺傳標(biāo)記基因

多克隆位點(diǎn)（MCS）一段短的DNA序列，含有多種單一限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，是外源基因插入的位點(diǎn)。（二）質(zhì)粒載體的特點(diǎn)與類型質(zhì)粒載體關(guān)鍵元件：復(fù)制起點(diǎn)、選擇性標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)：供自主復(fù)制用的由復(fù)制起始位點(diǎn)和調(diào)控基因組成的短序列第27頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：分子量小，便于操作易于構(gòu)建，可作為其他宿主系統(tǒng)載體的骨架用途廣泛缺點(diǎn)：裝載量?。ㄐ∮?0kb），不能用來克隆大片段第28頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三（二）質(zhì)粒載體的類型人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類：高拷貝質(zhì)粒突變拷貝數(shù)控制基因拷貝數(shù)1000-3000擴(kuò)增基因低拷貝質(zhì)粒來自pSC101拷貝數(shù)小于10

表達(dá)某些毒性基因溫敏質(zhì)粒在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)測(cè)序質(zhì)粒含有測(cè)序通用引物互補(bǔ)序列整合質(zhì)粒裝有促進(jìn)整合的基因，便于外源基因的整合穿梭質(zhì)粒

裝有針對(duì)兩種不同受體的復(fù)制子，便于基因克隆表達(dá)質(zhì)粒

裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件探針質(zhì)粒

裝有報(bào)告基因，便于啟動(dòng)子等元件的克隆篩選第29頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三（三）重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體松弛型復(fù)制1、pBR322：

氯霉素可擴(kuò)增拷貝數(shù)50-100/cell用于基因克隆

用自己所學(xué)的知識(shí)分析該質(zhì)粒有何優(yōu)缺點(diǎn)？第30頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)：

1、具有較小的分子量；它的分子量為4363bp。克隆載體的分子量大小不要超過10kb。

2、具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)。pBR322DNA分子中總共有24種核酸內(nèi)切酶只具有單一的酶切識(shí)別位點(diǎn)。其中9個(gè)限制酶切位點(diǎn)插入外源片斷可以導(dǎo)致tetr

基因的失活；另外有3種限制酶在氨芐青霉素抗性基因有單一的識(shí)別位點(diǎn)，3、具有較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素?cái)U(kuò)增之后每個(gè)細(xì)胞中可積累1000~3000個(gè)拷貝。

第31頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三第32頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三抗藥性標(biāo)志的選擇pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板第33頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三

pBR322質(zhì)粒載體的改良為了更加實(shí)用，人們對(duì)pBR322質(zhì)粒進(jìn)行了改良，得到許多pBR322質(zhì)粒衍生質(zhì)粒，它們各自具有不同的特點(diǎn)。第34頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三

PUC質(zhì)粒：人們?cè)趐BR322的基礎(chǔ)上，組入了一個(gè)在其5’-端帶有一段多克隆位點(diǎn)的lacZ’基因，而發(fā)展的具有雙功能檢測(cè)特性的新型質(zhì)粒載體系列。

第35頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三2、pUC18/19：最優(yōu)秀的常規(guī)克隆載體

拷貝數(shù)2000-3000/cell用于基因克隆和測(cè)序，T載體的母載體

裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）含AP和正選擇顏色標(biāo)記lacZ’第36頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三

一種典型的pUC系列的質(zhì)粒載體，包括以下四個(gè)部分：

1、來自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)（ori）；

2、氨芐青霉素抗性基因（ampr

）,但它的DNA核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不再含有原來的核酸內(nèi)切限制酶的識(shí)別位點(diǎn)。

3、大腸桿菌β-半乳糖基因（lacZ）的啟動(dòng)子及編碼α-肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)稱之為lacZ’基因；

4、位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位點(diǎn)（MCS）區(qū)段。但它并不破壞該基因的功能。第37頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三pUC18/19：正選擇標(biāo)記lacZ’的顯色原理（α互補(bǔ)）pUC18/19PlaclacZ’MCSb-半乳糖苷酶的a-肽段ab5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal第38頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三第39頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)第一，具有較小的分子量和更高的拷貝數(shù);

僅保留了pBR322的氨芐青霉素抗性基因和復(fù)制起點(diǎn)；在操作過程中復(fù)制起點(diǎn)內(nèi)部發(fā)生了自發(fā)突變?cè)斐闪嘶騬op的缺失，它是控制質(zhì)粒的特殊因子，從而使拷貝數(shù)增加，平均每個(gè)細(xì)胞500~700個(gè)拷貝。第二，適用于組織化學(xué)檢測(cè)重組體；具有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ’基因，所編碼的α-肽鏈可參與α-互補(bǔ)作用，用Xgal顯色對(duì)重組子進(jìn)行鑒定。第三，具有多克隆位點(diǎn)MCS區(qū)段．方便具有不同粘性末端的外源片斷的插入。第40頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三3、T載體：克隆PCR產(chǎn)物用多克隆位點(diǎn)中某處線性化，加裝堿基T，以便和PCR產(chǎn)物的A互補(bǔ)。pMD18-T？？？？第41頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三

第42頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三MCS第43頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三T-vector兩條鏈的3’端含有一個(gè)游離的TPCR過程中，普通的Taq酶可在產(chǎn)物的3’端多加一個(gè)AT-A克隆第44頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三第45頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三4、pGEM：多拷貝裝有兩個(gè)噬菌體的強(qiáng)啟動(dòng)子裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）正選擇顏色標(biāo)記lacZ’用于外源基因的高效表達(dá)

注意：T7和SP6啟動(dòng)子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合酶所識(shí)別，因此相應(yīng)的受體菌必須表達(dá)噬菌體RNA聚合酶，如：2743bpMCSlacZ’PT7oriAprpGEM-3EPSP6E.coliBL21（DE3）等第46頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三第一次課所授重點(diǎn)內(nèi)容的回顧第47頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三第二章分子克隆單元操作2.2

2.3

2.1

用于基因克隆的載體DNA的體外重組（切與接）目的基因的克隆2.4

轉(zhuǎn)化與擴(kuò)增（轉(zhuǎn)與增）轉(zhuǎn)化子的篩選與重組子的鑒定（檢）2.5

第48頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三2.1用于基因克隆的載體質(zhì)粒載體噬菌體或病毒載體考斯質(zhì)粒與噬菌粒人工染色體載體載體的基本概念第49頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三一、載體的基本概念載體（Vector）：是把外源DNA（目的基因）導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使之傳代、擴(kuò)增或表達(dá)的工具。2、載體應(yīng)具備的條件1、載體的主要功能3、載體的類型（重點(diǎn)）

1）按功能分；2）按傳代特性分；3）按來源分穿梭載體有什么作用？？？？第50頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三二、質(zhì)粒(plasmid)質(zhì)粒的生物學(xué)特性（幾個(gè)基本概念）嚴(yán)緊型/松弛型；不相容性；氯霉素?cái)U(kuò)增質(zhì)粒載體的特點(diǎn)與類型（關(guān)鍵元件、特點(diǎn)）重要的質(zhì)粒載體（pBR322；pUC18/19；T載體）第51頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三選擇性標(biāo)記：供轉(zhuǎn)化子/重組子篩選用的遺傳標(biāo)記基因

多克隆位點(diǎn)（MCS）供外源基因插入的、由單一切點(diǎn)內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)組成的序列質(zhì)粒載體關(guān)鍵元件：復(fù)制位點(diǎn)、選擇性標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)復(fù)制位點(diǎn)：供自主復(fù)制用的由復(fù)制起始位點(diǎn)和調(diào)控基因組成的短序列第52頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體松弛型復(fù)制1、pBR322：

氯霉素可擴(kuò)增拷貝數(shù)50-100/cell用于基因克隆

第53頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三2、pUC18/19：最優(yōu)秀的常規(guī)克隆載體

拷貝數(shù)2000-3000/cell用于基因克隆和測(cè)序，T載體的母載體

裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）正選擇顏色標(biāo)記lacZ’第54頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三本次課內(nèi)容

第55頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三（四）質(zhì)粒DNA的制備與鑒定實(shí)驗(yàn)室一般使用下列三種方法制備質(zhì)粒DNA：氯化銫密度梯度離心法

質(zhì)粒DNA純度高、周期長(zhǎng)、設(shè)備要求高、溴乙錠污染堿裂解法

質(zhì)粒DNA純度底、快速、操作簡(jiǎn)便沸水浴法

質(zhì)粒DNA純度、操作周期介于氯化銫法和沸水浴法之間第56頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三氯化銫密度梯度離心法：

對(duì)質(zhì)粒的構(gòu)象要求較高時(shí)采用用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁加CsCl和溴乙錠超速離心過夜在紫外燈下吸取cccDNA稀釋沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs第57頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三第58頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三堿裂解法：

最常用用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁

加NaOH和SDS的混合溶液，去膜釋放內(nèi)含物

加高濃度的醋酸鉀溶液，沉淀染色體，去除染色體DNA及大部分蛋白質(zhì)離心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白質(zhì)乙醇或異丙醇沉淀水相質(zhì)粒DNA用無DNase的RNase去除殘余的RNA

cccDNAL-DNAocDNA第59頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三構(gòu)型：l-DNAoc-DNAccc-DNA第60頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三沸水浴法：

用含有EDTA和TritonX-100的緩沖液懸浮菌體加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁沸水浴40秒鐘離心，用無菌牙簽挑去沉淀物乙醇或異丙醇沉淀質(zhì)粒DNA第61頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三影響質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的因素（1）寄主菌株的遺傳背景

一般建議使用endA基因發(fā)生突變的大腸桿菌寄主菌株，例如DH5α、JM109以及XL1-Blue等。EndA基因突變的結(jié)果，使大腸桿菌寄主細(xì)胞失去了合成具有功能活性的核酸內(nèi)切酶I的能力，從而增進(jìn)了所含有的質(zhì)粒DNA分子的穩(wěn)定性。所以從這類寄主細(xì)胞中制備的質(zhì)粒DNA不僅在質(zhì)量上有所改進(jìn)，同時(shí)在產(chǎn)量上也得到了提高。（2）質(zhì)粒的拷貝數(shù)及分子大小

質(zhì)粒分子拷貝數(shù)的多寡和質(zhì)粒分子大小是決定其DNA產(chǎn)量的重要因素之一。第62頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三（五）質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性問題一、質(zhì)粒載體不穩(wěn)定性的類型分離的不穩(wěn)定性：在細(xì)胞分裂過程中發(fā)生的質(zhì)粒不平均的分配，有的細(xì)胞沒有獲得質(zhì)粒DNΑ拷貝，并最終增殖成為無質(zhì)粒的優(yōu)勢(shì)群體結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性：由轉(zhuǎn)位作用和重組作用所引起的質(zhì)粒DNΑ的重排與缺失。

一般而言，形成無質(zhì)粒細(xì)胞的頻率相當(dāng)?shù)停虼嗽谝话闱闆r下通過隨機(jī)分配質(zhì)粒亦能夠得到穩(wěn)定的遺傳。第63頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三二、影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素

新陳代謝負(fù)荷對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的效應(yīng)

拷貝數(shù)差度對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的影響寄主重組體系對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的效應(yīng)

（五）質(zhì)粒載體的穩(wěn)定性問題不同細(xì)胞個(gè)體之間的質(zhì)粒載體拷貝數(shù)的差異程度，簡(jiǎn)稱差度低差度-穩(wěn)定高差度-不穩(wěn)定質(zhì)粒重組的重要結(jié)果是形成質(zhì)粒寡聚體，它同樣是造成質(zhì)粒載體不穩(wěn)定性的原因之一。重組的質(zhì)粒二聚體一旦形成，便會(huì)以高出質(zhì)粒單體分子兩倍的速度進(jìn)行復(fù)制，從而導(dǎo)致出現(xiàn)質(zhì)粒寡聚體的克隆增殖，

第64頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三二、噬菌體或病毒DNA噬菌體：細(xì)菌的病毒，常開發(fā)為克隆載體病毒：動(dòng)、植物的病毒，常開發(fā)為表達(dá)載體共同特點(diǎn)：高效率的感染性能使外源基因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增第65頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三噬菌體基本知識(shí)一．噬菌體的結(jié)構(gòu)及其核酸類型根據(jù)噬菌體顆粒的結(jié)構(gòu)，可歸納為三種不同的基本類型：無尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型、具尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型和線狀體型。大多數(shù)噬菌體，都是屬于第二種結(jié)構(gòu)類型噬菌體的核酸，最常見的是雙鏈線性DNA。除此之外，還發(fā)現(xiàn)有雙鏈環(huán)形DNA、單鏈環(huán)形DNA、單鏈線性DNA以及單鏈RNA等多種形式的噬菌體。有些噬菌體的DNA堿基并不是由標(biāo)準(zhǔn)的A、T、G、C四種堿基組成。例如，T4噬菌體DNA中就沒有C堿基。

二、噬菌斑：噬菌體細(xì)胞,導(dǎo)致寄主細(xì)胞溶解死亡.因而在瓊脂培養(yǎng)基表面形成的空斑.

第66頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三一般溶原性噬菌體的噬菌斑中央殘存著已溶原化的細(xì)胞，故成為混濁噬菌斑。相反，烈性噬菌體則形成透明噬菌斑。第67頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三噬菌體的生命周期分為溶菌周期和溶源周期兩種不同的類型。在溶菌周期噬菌體將其感染的寄主細(xì)胞轉(zhuǎn)變成為噬菌體的“制造廠”，能產(chǎn)生出大量的子代噬菌體顆粒。我們將只具有溶菌生長(zhǎng)周期的噬菌體叫做烈性噬菌體。

溶源生長(zhǎng)周期，是指在感染過程中沒有產(chǎn)生出子代噬菌體顆粒，噬菌體DNA是整合到寄主細(xì)胞染色體DNA上，成為它的一個(gè)組成部分。具有這種溶源周期的噬菌體，叫做溫和噬菌體?，F(xiàn)已知道，只有雙鏈DNA的噬菌體才具有溶源周期。

噬菌體基本知識(shí)第68頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三（一）大腸桿菌的l噬菌體DNA1、l噬菌體的生物學(xué)特性：l噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體l噬菌體由外殼包裝蛋白和l-DNA組成

l-DNA是線性雙鏈DNA分子，全長(zhǎng)48502個(gè)核苷酸l-DNA上至少有61個(gè)基因lDNA兩端各帶有一個(gè)12bp的粘性末端，稱為cos位點(diǎn)。噬菌體感染細(xì)菌以后，雙鏈DNA分子通過COS位點(diǎn)成環(huán)狀第69頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三l噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOSCos位點(diǎn)（12bp）頭部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重組基因刪除與整合基因l-DNA第70頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三l噬菌體的兩種途徑第71頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三l噬菌體的裂解途徑——生活史E.coli吸附LamB受體注入復(fù)制包裝裂解lamB受體：麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白第72頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三l噬菌體的裂解途徑——l噬菌體的體內(nèi)包裝包裝范圍為原DNA的75-105%：36-51

kb體內(nèi)包裝100個(gè)左右的拷貝包裝范圍為原DNA的75-105%即36-51

kbDA串連多聚體先行θ復(fù)制，再經(jīng)環(huán)滾式復(fù)制形成串聯(lián)重復(fù)第73頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三第74頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三滾環(huán)方式（rollingcircle）D.S.DNA→

Nick→

leadingStrand→Elongation→

rolling第75頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三l噬菌體的溶原狀態(tài)l噬菌體感染大腸桿菌后，除能裂解細(xì)胞外，也可能將其DNA直接整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA上，并不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒，這種情況為溶原狀態(tài)。整合主要由l-DNA上的cI和int兩基因的產(chǎn)物所激活，而這兩個(gè)基因的開放與關(guān)閉又取決于宿主細(xì)胞本身的性質(zhì)。人們可以根據(jù)需要改變l-DNA或宿主細(xì)胞的性質(zhì)，使噬菌體或處于溶菌狀態(tài)，或處于溶原狀態(tài)

DNA重組技術(shù)一般需要l噬菌體進(jìn)入溶菌狀態(tài)第76頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三2、l-DNA載體的構(gòu)建：1）縮短長(zhǎng)度：按有效包裝范圍確定野生型l-DNA包裝的上限為51kb，本身長(zhǎng)度為48.5kb，只有當(dāng)插入的外源DNA片段不大于2.5kb時(shí)，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型l-DNA的長(zhǎng)度，可以提高裝載量。其實(shí)野生型l-DNA上約有40-50%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的。根據(jù)切除的多少，可將l-DNA分成兩大類載體：插入型載體取代型載體第77頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三插入型l-DNA載體：載量為0-14KB體外包裝插入位點(diǎn)體外包裝插入片段載體長(zhǎng)度37kb插入片段大?。?-14kb（51–37）改造后的長(zhǎng)度正好為包裝的下限，因而本身也能被包裝，叫插入型載體第78頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三插入型載體：

cI基因插入失活：如λgt10、λNM1149等載體，在cI基因上有EcoRI及HindIII的酶切位點(diǎn)。外源基因插入后將導(dǎo)致cI基因的失活。cI基因失活后將導(dǎo)致噬菌體不能溶原化，產(chǎn)生清晰的噬菌斑。相反，產(chǎn)生混濁的噬菌斑。LacZ基因插入失活：如charon16A載體，在非必須區(qū)段引入lacZ基因，在lacZ基因上有EcoRI位點(diǎn)，插入失活后利用X-gal法篩選（藍(lán)白篩選）。

第79頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三第80頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三取代型l-DNA載體：載量為10-25kb體外包裝體外包裝插入片段最小裝載長(zhǎng)度10kb（51–26）載體長(zhǎng)度26kb插入片段最大裝載長(zhǎng)度25kb（36–26）長(zhǎng)度為40kb，在非必需區(qū)域有酶切位點(diǎn)，距離為14kb第81頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三第82頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三思考用取代型載體克隆外源DNA可能需要經(jīng)過哪些步驟？第一，應(yīng)用適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切限制酶消化λ載體，除去基因組中可取代的

DNA區(qū)段。第二，將上述所得的λ

DNA臂同外源DNA片段連接。第三，對(duì)重組體的λDNA分子進(jìn)行包裝和增殖，以得到有感染性的λ重組

噬菌體。

第83頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三2）刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)，引入多克隆位點(diǎn)野生型的l-DNA鏈上有5個(gè)EcoRI位點(diǎn)和7個(gè)HindIII位點(diǎn)，不利于重組操作，必須刪除至1-2個(gè)同時(shí)，為了便于各種來源的DNA片段的克隆，還需要增加一些單一的酶切位點(diǎn)可以怎么刪除或引入？？除了簡(jiǎn)單的切割外，還需要采用定點(diǎn)突變技術(shù)去除或增添酶位點(diǎn)第84頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三3）加裝選擇標(biāo)記與質(zhì)粒不同，野生型l-DNA上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此加裝選擇標(biāo)記是l-DNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容l-DNA克隆載體上的選擇標(biāo)記主要有下列兩類：免疫功能類標(biāo)記顏色反應(yīng)類標(biāo)記第85頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三加裝選擇標(biāo)記：imm434imm434基因編碼一種阻止l-噬菌體進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記基因的l-載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立溶原狀態(tài)，細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，形成渾濁斑；當(dāng)外源DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅活，l-重組分子便進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成透明斑透明斑渾濁斑第86頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三加裝選擇標(biāo)記：lacZlacZ基因編碼b-半乳糖苷酶，能催化無色的X-gal生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能合成藍(lán)色化合物；而空載體l-DNA則產(chǎn)生藍(lán)色透明斑第87頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三4）構(gòu)建琥珀密碼子的突變體（環(huán)保的需要）

琥珀型突變（sup)：由CAG（Gln）向UAG（stop）的突變。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產(chǎn)物校正tRNA能專一性地糾正這一突變。將野生型l-DNA上D和E兩個(gè)頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變成UAG。當(dāng)這種l-DNA進(jìn)入一般的大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細(xì)菌，這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴(kuò)散，而基因工程實(shí)驗(yàn)中使用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株第88頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三無義突變使UUG變?yōu)閁AGLeu-tRNA閱讀UAG密碼子AUGUUGUAAAUGUAGUAAAUGUAGUAAAUGUUGUAAAACAUC

AAG

釋放因子

抑制突變

LeuLeuLeu圖14－17帶有突變反密碼子的tRNA可抑制無義突變第89頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三3、l-DNA及其重組分子的分離純化：將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期

加入l噬菌體或重組l噬菌體的懸浮液，37℃培養(yǎng)1小時(shí)

用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4-12小時(shí)。這時(shí)噬菌體顆粒

密度已達(dá)1013-1014/L，大腸桿菌細(xì)胞已完全裂解

超速離心，沉淀噬菌體苯酚抽提，釋放l-DNA

乙醇或異丙醇沉淀l-DNA

第90頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三4、l-DNA重組分子的體外包裝：l-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞。用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了l噬菌體的大腸桿菌中提取，現(xiàn)已商品化。這些包裝蛋白通常分為相互互補(bǔ)的兩部分：一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。包裝時(shí)，當(dāng)且僅當(dāng)這兩部分包裝蛋白與重組l-DNA分子混合后，包裝才能有效進(jìn)行，任何一種蛋白包裝液被重組l-DNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設(shè)計(jì)的第91頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三5、l-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)：l-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌

l-DNA載體的裝載能力為25kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量重組l-DNA分子的篩選較為方便

重組l-DNA分子的提取較為簡(jiǎn)便

l-DNA載體適合克隆和擴(kuò)增外源DNA片段，但不適合表達(dá)

外源基因第92頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三（二）大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNA1、M13噬菌體的生物學(xué)特性：M13噬菌體的外型呈絲狀M13

噬菌體由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成

致使比其他區(qū)域的宿主生長(zhǎng)慢,形成混濁噬菌斑M(jìn)13DNA上至少有10個(gè)基因2700個(gè)外殼蛋白分子M13

噬菌體不裂解宿主細(xì)胞，但抑制其生長(zhǎng)第93頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三M13噬菌體載體

M13是一種含單鏈（+）DNA（ssDNA）的絲狀大腸桿菌噬菌體，其基因組大小為6.4kb。這類載體主要用來獲得大量的單鏈ＤＮＡ片段，這種單鏈ＤＮＡ片段在遺傳學(xué)研究中主要用來測(cè)定ＤＮＡ序列（sanger雙脫氧法）、基因的定點(diǎn)突變研究、異源雙鏈DNA的分析等。第94頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三 大小：6.4kb

結(jié)構(gòu)：10個(gè)區(qū)基因間隔區(qū)（IS區(qū)）

含復(fù)制起始位點(diǎn)及可插入外源DNA的位點(diǎn)第95頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三M13噬菌體的感染周期+DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA-DNAIIV第96頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三2、M13DNA載體的構(gòu)建與改造IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列載體lacZ‘polylinkerMCS插入多克隆位點(diǎn)和標(biāo)記基因第97頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三3、M13DNA載體的特點(diǎn)：使克隆的DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細(xì)胞外這在DNA定向突變中非常有用M13重組分子篩選簡(jiǎn)便被M13噬菌體感染的受體細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，形成混濁斑，易于辨認(rèn)挑選。而且重組分子越大，混濁斑的混濁度亦越大但M13-DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有1.5kb第98頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三（三）病毒載體與動(dòng)植物受體細(xì)胞相適應(yīng)的載體一般選擇相應(yīng)動(dòng)植物的病

毒基因組DNA。動(dòng)植物病毒種類繁多，每一種動(dòng)植物都有多種特異性的病毒。按照基因組的結(jié)構(gòu)，可將動(dòng)植物病毒分成四大類：?jiǎn)捂淒NA病毒雙鏈DNA病毒單鏈RNA病毒雙鏈RNA病毒RNA病毒在自我復(fù)制時(shí)大多存在相應(yīng)的DNA中間反應(yīng)物，這些中間體可作為載體進(jìn)行常規(guī)的DNA重組。第99頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三動(dòng)物病毒載體

(1)具有能在動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制的復(fù)制起始位點(diǎn)(2)具有在動(dòng)物細(xì)胞中能表達(dá)的選擇標(biāo)記(3)具有大腸桿菌質(zhì)粒載體的復(fù)制起始位點(diǎn)、選擇標(biāo)記和多克隆位點(diǎn)目前常用的基因轉(zhuǎn)移載體有：(1)猴空泡病毒(Simianvirus40簡(jiǎn)稱SV40)；(2)腺病毒(Adenovirus)；(3)乳頭狀病毒(Papillomavirus)；(4)逆轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovirus);(5)牛痘(Vaccinia)病毒;(6)牛疣病毒(Bovinepapillomavirus)等。第100頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三考斯質(zhì)粒（cosmid）考斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建：考斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有1978年Collins和Hohn發(fā)明構(gòu)建pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalIl-DNAcos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的載體cossite-carryingplasmid1.8kb的l-DNA片段+pBR322片段裝載范圍為31-45kb三、考斯質(zhì)粒與噬菌粒第101頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三考斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：能像l-DNA那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞

裝載量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范圍能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制重組操作簡(jiǎn)便，篩選容易不能體內(nèi)包裝，不裂解受體細(xì)胞第102頁，講稿共113頁，2023年5月2日，星期三噬菌粒（phagemidorphasmid）噬菌粒載體的特點(diǎn)：噬菌粒是一類人工構(gòu)建的含有單鏈?zhǔn)删w包裝序列、復(fù)制起始位點(diǎn)以及質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)、克隆位點(diǎn)、標(biāo)記基因的特殊類型的載體能像M13-DNA那樣體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞

裝載量比常規(guī)的M13mp系列要大很多（10kb）能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制重組操作簡(jiǎn)便，篩選容易通過克隆雙鏈DNA能獲得同等長(zhǎng)度的單一單鏈DNA第103頁，講稿共113