細(xì)胞培養(yǎng)常用技術(shù)_第1頁(yè)
細(xì)胞培養(yǎng)常用技術(shù)_第2頁(yè)
細(xì)胞培養(yǎng)常用技術(shù)_第3頁(yè)
細(xì)胞培養(yǎng)常用技術(shù)_第4頁(yè)
細(xì)胞培養(yǎng)常用技術(shù)_第5頁(yè)
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細(xì)胞培養(yǎng)常用(chánɡyònɡ)技術(shù)第一頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選pptCell第一類(lèi)研究方法形態(tài)觀察(guānchá)技術(shù)第二類(lèi)研究方法生物化學(xué)分析(huàxuéfēnxī)技術(shù)第三類(lèi)研究(yánjiū)方法V細(xì)胞生理學(xué)技術(shù)第四類(lèi)研究方法其它實(shí)驗(yàn)技術(shù)第二頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)(jiégòu)觀察技術(shù)目鏡物鏡集光器載物臺(tái)光源1.普通(pǔtōng)光鏡的結(jié)構(gòu):(一)普通(pǔtōng)光學(xué)顯微鏡一、光學(xué)顯微鏡第三頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt第四頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt2.普通(pǔtōng)光鏡的成像原理2圖像樣品光線聚光器物鏡光學(xué)顯微鏡的光路圖第五頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt分辨率分辨率指顯微鏡能將近鄰的兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)分辨清楚的能力,通常是用相鄰兩點(diǎn)間的距離來(lái)表示.與數(shù)值孔徑的關(guān)系:D=0.61λ/NA=0.61λ/N·sin(α/2)D為分辨率;λ為光波波長(zhǎng);要提高分辨率,可采取使用短波長(zhǎng)光源、采用介質(zhì)(jièzhì)折射率高的袖浸系、增大孔徑角以提高NA值等措施。第六頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt倒置顯微鏡第七頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt生長(zhǎng)良好的細(xì)胞,在顯微鏡下可觀察到細(xì)胞透明度大,折光性強(qiáng),輪廓不清。若細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不良,可見(jiàn)細(xì)胞輪廓增強(qiáng),細(xì)胞折光性變?nèi)酰?xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物質(zhì),細(xì)胞之間空隙增大,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,甚至失去原有細(xì)胞的特點(diǎn),產(chǎn)生(chǎnshēng)圓縮脫落,有時(shí)細(xì)胞表面及周?chē)霈F(xiàn)絲絮狀物。顯微鏡觀察(guānchá)細(xì)胞(xìbāo)的生長(zhǎng)狀態(tài)第八頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選pptBMSCs第九頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)(shēngzhǎng)過(guò)程第十頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選pptAnip973第十一頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt在普通光學(xué)顯微鏡下,細(xì)胞結(jié)構(gòu)呈半透明狀,不易(bùyì)看清。往往將標(biāo)本切片進(jìn)行(jìnxíng)染色——提高可辨程度。移動(dòng)臂蠟或樹(shù)脂包埋的樣品切片用鋼刀樣品切片蠟帶伸展在蓋玻片和載玻片之間的切片切片機(jī)第十二頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt染色的原理未染色(rǎnsè)已染色(rǎnsè)第十三頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt(二)暗視野顯微鏡這種顯微鏡使照明光線不能直接(zhíjiē)進(jìn)入物鏡,只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡。中央(zhōngyāng)遮光板第十四頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt暗視野聚光器的設(shè)計(jì)原理視野的背景(bèijǐng)黑物體的邊緣亮第十五頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt利用這種顯微鏡能見(jiàn)到小至5nm的質(zhì)點(diǎn),分辨率比普通(pǔtōng)顯微鏡高了40倍,有一些細(xì)胞器,如核、線粒體,均清晰可見(jiàn)。第十六頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt(三)相差(xiānɡchà)顯微鏡由荷蘭物理學(xué)家F.Zernike(1932)發(fā)明:提高了活細(xì)胞結(jié)構(gòu)的反差,從而解決了對(duì)活細(xì)胞觀察(guānchá)的難題。獲諾貝爾物理獎(jiǎng)(1953)(phasecontrastmicroscope)光通過(guò)不同密度物質(zhì)時(shí)滯留的時(shí)間不同,利用相差板,將厚度(hòudù)的差別轉(zhuǎn)化成明暗的差別,增加反差。第十七頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt特點(diǎn):在聚光器或光源上加了一環(huán)形(huánxínɡ)光闌(annulardiaphragm),在物鏡中加了一環(huán)形相板(annularphaseplate)。相差(xiānɡchà)顯微鏡的構(gòu)造:上有一環(huán)形區(qū),制成凹槽或凸起(亦可涂上特殊物質(zhì)):環(huán)形區(qū)的設(shè)計(jì)深度(或高度)恰好(qiàhǎo)可使通過(guò)此區(qū)的光線提前或延后1/4λ光程差。環(huán)形光闌環(huán)形相板使透過(guò)聚光器的光線形成空心光錐,焦聚到標(biāo)本上。第十八頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt相差(xiānɡchà)顯微鏡的構(gòu)造第十九頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt相差(xiānɡchà)顯微鏡的光路圖解根據(jù)設(shè)計(jì),只有未透過(guò)標(biāo)本的直射光可通過(guò)相板環(huán)形區(qū),而透過(guò)標(biāo)本的偏折光則由相板其他部分通過(guò)。兩組光線和軸后發(fā)生(fāshēng)干涉現(xiàn)象。第二十頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt兩組光線合軸后光波相減,振幅變小,形成暗反差(fǎnchā)(正反差)——結(jié)構(gòu)比周?chē)橘|(zhì)更加變暗。未透過(guò)(tòuɡuò)標(biāo)本的直射光(通過(guò)相板環(huán)形區(qū))與透過(guò)標(biāo)本的偏折光(由相板其他部分通過(guò))和軸后發(fā)生干涉:S-DSD如果(rúguǒ)為凹形相板:通過(guò)樣品的光線延后1/4λ-1/4λ-1/4λ第二十一頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt則兩組光波相加,振幅加大,形成亮反差(負(fù)反差)——標(biāo)本(biāoběn)結(jié)構(gòu)比周?chē)橘|(zhì)更加變亮。S+DSD如果(rúguǒ)為凸性相板:由于標(biāo)本的各種結(jié)構(gòu)的厚度和折射系數(shù)(xìshù)不同,在相差顯微鏡下顯示出不同的明暗度。-1/4λ+1/4λ第二十二頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt顯微鏡觀察(guānchá)

相差顯微鏡(phasecontrastmicroscope)活細(xì)胞對(duì)光線是透明的,光線通過(guò)活細(xì)胞時(shí),波長(zhǎng)和振幅幾乎沒(méi)有改變,所以用普通光鏡無(wú)法看清未經(jīng)染色的活細(xì)胞。

20世紀(jì)30年代荷蘭Zernike

原理:利用光的衍射和干涉特性,把透過(guò)標(biāo)本不同區(qū)域的光波的光程差轉(zhuǎn)變成振幅差,使細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)(jiégòu)之間呈現(xiàn)清晰可見(jiàn)的明暗對(duì)比,從而使標(biāo)本的各種結(jié)構(gòu)(jiégòu)變得清晰。

第二十三頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt相差顯微鏡觀察(guānchá)活細(xì)胞的步驟如下:調(diào)整(tiáozhěng)好相差顯微鏡

觀察(guānchá)瓶皿準(zhǔn)備調(diào)光調(diào)焦與攝影細(xì)胞觀察第二十四頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt第二十五頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt(四)微分(wēifēn)干涉差顯微鏡Nomarski(1952)在相差(xiānɡchà)顯微鏡原理的基礎(chǔ)上發(fā)明的:又稱(chēng)Nomarski相差顯微鏡,其優(yōu)點(diǎn)是能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影影像。(differentialinterferencecontrast(DIC)microscope)與相差顯微鏡相比,其標(biāo)本(biāoběn)可略厚一點(diǎn),折射率差別更大。第二十六頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選pptDIC顯微鏡首先DIC利用的是偏振光。此外,除了物鏡外,還增加(zēngjiā)了四個(gè)光學(xué)組件:偏振器(polarizer)、DIC棱鏡、DIC滑行器和檢偏器(analyzer)。DIC顯微鏡使細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)立體感特別強(qiáng),適合于顯微操作。目前像基因注入、核移植等生物工程(shēnɡwùɡōnɡchénɡ)的顯微操作常在這種顯微鏡下進(jìn)行。第二十七頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選pptDIC顯微鏡暗視野顯微鏡相差顯微鏡普通顯微鏡第二十八頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt熒光(yíngguāng)顯微鏡的成象原理(五)熒光(yíngguāng)顯微鏡第二十九頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt分裂細(xì)胞的免疫熒光圖像(túxiànɡ)不同(bùtónɡ)熒光染料標(biāo)記(biāojì)抗體特異性結(jié)合免疫熒光技術(shù)抗原(細(xì)胞的蛋白質(zhì)成分)第三十頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt用熒光素標(biāo)記抗體所顯示出的細(xì)胞中蛋白質(zhì)的分布(fēnbù)狀態(tài)MPM-2DAPIMergedInterProMetaAnteTelo第三十一頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt(六)激光(jīguāng)共聚焦顯微鏡(LaserConfocalMicroscope,LCM)光源(guāngyuán):通過(guò)共聚焦可進(jìn)行光學(xué)切片對(duì)固相、液相物體(wùtǐ)均可進(jìn)行觀察特點(diǎn):激光Q550MW型LCM第三十二頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt二.主要電鏡制作(zhìzuò)技術(shù)三.掃描(sǎomiáo)隧道顯微鏡一.電鏡基本知識(shí)二、電子顯微鏡電鏡問(wèn)世(wènshì)的必然性第三十三頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt光學(xué)(guāngxué)顯微鏡→0.2μm電子顯微鏡→0.2nm透射(tòushè)電子顯微鏡(transmissionelectronmicroscope,TEM)掃描電子顯微鏡(scanningelectronmicroscope,SEM)第三十四頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt電子顯微鏡與光鏡的主要(zhǔyào)區(qū)別電鏡光鏡電子束可見(jiàn)光電磁透鏡玻璃透鏡電磁聚焦機(jī)械聚焦超薄切片(0.05m)石蠟切片(1~10m)光源透鏡聚焦方式切片厚度圖像彩色圖像黑白圖像第三十五頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt0.61λ

D=——————N·Sinα/2λ:波長(zhǎng)(bōcháng)

N:介質(zhì)(jièzhì)折射率

α:物鏡鏡口角(標(biāo)本(biāoběn)在光軸的一點(diǎn)對(duì)物鏡鏡口的張角)通常α最大值可達(dá)140°,空氣中N=1,最短的可見(jiàn)光波長(zhǎng)λ=450nm,因此,普通光鏡的最大分辨率是0.2μm。肉眼的分辨率為0.2mm,因此,光學(xué)顯微鏡的最大的放大倍數(shù)為1000。放大倍數(shù)=顯微鏡的分辨率人肉眼的分辨率分辨力(resolution)是指顯微鏡能將近鄰的兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)分辨清楚的能力,通常是用相鄰兩點(diǎn)間的距離來(lái)表示,可通過(guò)公式換算出:一、電鏡基本知識(shí):第三十六頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt各種(ɡèzhǒnɡ)光及電子束的波長(zhǎng)第三十七頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選pptRuska(1933~1938)便選擇了電子束為光源來(lái)突破光學(xué)(guāngxué)顯微鏡分辨率的極限,發(fā)明了透射電子顯微鏡(transmissionelectronmicroscope,TEM)。電子束的波長(zhǎng)要比可見(jiàn)光和紫外光短得多,其波長(zhǎng)與發(fā)射(fāshè)電子束的電壓平方根成反比,也就是說(shuō)電壓越高波長(zhǎng)越短。V1λμ第三十八頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt透射(tòushè)式電子顯微鏡(TEM)第三十九頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt中幼紅細(xì)胞透射電鏡血小板縱切面透射電鏡第四十頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt由于(yóuyú)電子束不能透過(guò)玻璃,因此用于電鏡的標(biāo)本須制成厚度僅有0.05m的超薄切片,并放在銅網(wǎng)上。這種切片需要用超薄切片機(jī)制作。電子顯微鏡的放大倍數(shù)最高可達(dá)近百萬(wàn)倍。1.

超薄切片(qiēpiàn)技術(shù)二、主要電鏡制作(zhìzuò)技術(shù):超薄切片銅網(wǎng)第四十一頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt以鋨酸和戊二醛固定樣品,以環(huán)氧樹(shù)脂包埋,以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式推進(jìn)樣品切片,切片厚度20~50nm,切片采用重金屬鹽染色,以增大(zēnɡdà)黑白反差。第四十二頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt用重金屬鹽(如磷鎢酸、醋酸雙氧鈾)對(duì)鋪展在載網(wǎng)上的樣品進(jìn)行染色;吸去染料,樣品干燥后,樣品凹陷處鋪了一薄層重金屬鹽,而凸出處則沒(méi)有染料沉積,從而出現(xiàn)負(fù)染效果(xiàoguǒ),分辨力可達(dá)1.5nm左右。示肌動(dòng)蛋白纖維

2.負(fù)染色(rǎnsè)技術(shù)第四十三頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt亦稱(chēng)冰凍斷裂(freeze-fracture),是研究生物膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)的一種有用的技術(shù),關(guān)于膜結(jié)構(gòu)的許多資料(zīliào)即是利用這種方法取得的。冰凍(bīngdòng)斷裂技術(shù)也是研究細(xì)胞內(nèi)部各種細(xì)胞器結(jié)構(gòu)的有用手段。(freeze-etching)3.冰凍蝕刻技術(shù)(jìshù)第四十四頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt①將標(biāo)本于-100℃干冰中或-196℃液氮中,超低溫冰凍。②然后用冷刀驟然(zhòurán)將標(biāo)本沖斷開(kāi),升溫后冰在真空條件下迅即升華,暴露出了斷裂面結(jié)構(gòu)——蝕刻(etching)。蝕刻斷裂冰凍蝕刻技術(shù)(jìshù)的操作步驟:第四十五頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt③蝕刻后,再向斷裂上噴涂一層蒸汽碳和鉑。然后(ránhòu)將組織溶掉,把碳和鉑的膜剝下,此膜即為復(fù)膜(replica)。復(fù)膜④復(fù)膜顯示(xiǎnshì)出了標(biāo)本蝕刻面的形態(tài),可置于透射電鏡下觀察。電鏡下的影像即代表標(biāo)本中細(xì)胞斷裂面處的結(jié)構(gòu)。第四十六頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt細(xì)胞冰凍(bīngdòng)斷裂后的電鏡圖像第四十七頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt電子槍發(fā)射出的電子束作為“探針”,在樣品表面進(jìn)行掃描,電子束激發(fā)樣品表面放出次級(jí)電子,次級(jí)電子的多少(duōshǎo)與樣品表面的結(jié)構(gòu)有關(guān),被電荷的柵極收集后,即向電子顯象管發(fā)送信號(hào),在熒光屏上相應(yīng)位置顯示出明、暗差別。圖像為立體形象,反映了標(biāo)本表面的真實(shí)結(jié)構(gòu)。用來(lái)觀察標(biāo)本的表面(biǎomiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)。(scanningelectronmicroscope,SEM)4.

掃描電鏡技術(shù)(jìshù)第四十八頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt當(dāng)探針沿物質(zhì)表面掃描時(shí),使探針與物質(zhì)表面間的距離不斷發(fā)生改變,從而引起電流不斷發(fā)生改變。將電流的這種改變圖象化,即可顯示(xiǎnshì)出原子水平的凹凸形形態(tài)。探針物質(zhì)第四十九頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt掃描式電子顯微鏡第五十頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt掃描式電子顯微鏡第五十一頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt耳聽(tīng)毛的掃描電鏡圖像(túxiànɡ)第五十二頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt第五十三頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt第五十四頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt其關(guān)鍵部件是有一個(gè)加上一定(yīdìng)電壓的精密探針,當(dāng)探針接近物質(zhì)時(shí),由于‘隧道效應(yīng)’而有電子飛出,從而在探針與物質(zhì)之間有電流通過(guò)。1981年,Binnig、Rohrer等發(fā)明(fāmíng):榮獲(rónɡhuò)1986年諾貝爾獎(jiǎng)!據(jù)量子力學(xué)中隧道效應(yīng)設(shè)計(jì),用來(lái)顯示晶體表面原子布陣(scanningtunnelingmicroscope,STM)—+—+<100nm三、掃描隧道顯微鏡:第五十五頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt分辨率:X-Y向0.1nm(原子級(jí)分辨率)第五十六頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt掃描隧道顯微鏡能直接觀察生物大分子(如DNA、RNA和蛋白質(zhì)等)的原子布陣,也能觀察一些生物結(jié)構(gòu)(如生物膜、細(xì)胞壁等)的原子排列,而不需要特別的制樣技術(shù),并且探測(cè)過(guò)程對(duì)樣品無(wú)損傷——納米科學(xué)(kēxué)水平。掃描(sǎomiáo)隧道顯微鏡的優(yōu)越之處:三態(tài)(固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài))物質(zhì)均可進(jìn)行觀察。第五十七頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt細(xì)胞常用的觀察(guānchá)及染色方法第五十八頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt活細(xì)胞的觀察(guānchá)檢測(cè)方法暗視野顯微鏡技術(shù)觀察活細(xì)胞縮時(shí)顯微鏡攝影(shèyǐng)觀察體外活細(xì)胞染色觀察第五十九頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt暗視野顯微鏡技術(shù)觀察活細(xì)胞(darkfieldmicroscope)原理:利用特殊聚光器使光線不能進(jìn)入物鏡,經(jīng)過(guò)標(biāo)本的散射光線使物鏡被放大,因此在黑暗背景中可呈現(xiàn)明亮的像。優(yōu)點(diǎn):反差增大,分辨率提高,可觀察到5nm的微小質(zhì)點(diǎn)。應(yīng)用:觀察活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核、線粒體、細(xì)菌和霉菌等??s時(shí)顯微攝影術(shù)觀察(time-lapsecinemicrophotagraphy,TLCM)優(yōu)點(diǎn):可直接(zhíjiē)記錄活細(xì)胞的連續(xù)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程,能非常直觀地展現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化,如細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞分裂、細(xì)胞膜變化、細(xì)胞死亡等過(guò)程。缺點(diǎn):較昂貴第六十頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt體外活細(xì)胞(xìbāo)染色觀察體外活細(xì)胞染色(rǎnsè)就是在體外培養(yǎng)條件下,用某種染料對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色(rǎnsè),而不影響活細(xì)胞生命活動(dòng)的一種方法。利用這種方法,可以對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行染色(rǎnsè)觀察,經(jīng)染色(rǎnsè)的培養(yǎng)物還可以繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。堿性染料(rǎnliào)酸性染料(臺(tái)盼藍(lán)、剛果紅、吡咯藍(lán))活體染料噻嗪類(lèi)(次甲基藍(lán)、甲苯胺藍(lán))惡嗪類(lèi)(亮焦油藍(lán)、亮焦油紫)丫嗪類(lèi)(中性紅、詹納斯綠)三酚苯甲烷類(lèi)(甲基紫、維克多利亞藍(lán))第六十一頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt中性(zhōngxìng)紅染色

常用活體染料,一般濃度為1:10000,用生理鹽水(或Hanks液)溶解后進(jìn)行高壓蒸汽滅菌暗處存放,可直接浸染活體細(xì)胞顯微鏡下觀察或用于細(xì)胞的病毒蝕斑,肉眼計(jì)數(shù)空斑數(shù)目。因其毒性大,染色后細(xì)胞不能再培養(yǎng)。結(jié)晶紫染色使用濃度為0.1%,可用生理鹽水配制,室溫保存。該染料對(duì)死、活細(xì)胞均著色,故只能測(cè)出細(xì)胞總數(shù)。臺(tái)盼藍(lán)染色用0.5%濃度的臺(tái)盼藍(lán)(trypanblue),用PBS配制,室溫保存,該染料只對(duì)死細(xì)胞著色,可測(cè)定活細(xì)胞數(shù)和計(jì)算存活百分率。第六十二頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選pptE.coli以結(jié)晶(jiéjīng)紫(crystalviolet)染色第六十三頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選pptB.cereus以石炭酸復(fù)紅(carbolfuchsin)染色(rǎnsè)第六十四頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選pptaureus以甲烯藍(lán)(methyleneblue)染色(rǎnsè)第六十五頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt二、培養(yǎng)(péiyǎng)細(xì)胞常用的染色方法細(xì)胞固定的基本方法細(xì)胞常用(chánɡyònɡ)的染色方法細(xì)胞特殊的染色方法第六十六頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt1、細(xì)胞固定的基本(jīběn)方法固定組織、細(xì)胞的目的:把組織和細(xì)胞的原有結(jié)構(gòu)盡可能完整地保存下來(lái),避免組織和細(xì)胞發(fā)生降解、自溶、腐敗和變形等;同時(shí),固定還可以使細(xì)胞的各部分易于著色,適于觀察、長(zhǎng)期保存和分析。固定組織、細(xì)胞的原則:盡可能選用新鮮培養(yǎng)物;根據(jù)檢測(cè)工具、對(duì)象、目的和要求(yāoqiú)選擇固定劑和固定方法。第六十七頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt固定前的準(zhǔn)備:

各種細(xì)胞培養(yǎng)物,如雙蓋片懸滴培養(yǎng)物、懸液培養(yǎng)物、單層培養(yǎng)物和蓋片單層培養(yǎng)物都可作固定材料。

懸浮細(xì)胞:離心(líxīn)(800~1000r/min)→PBS/Hanks漂洗2~3次

貼壁細(xì)胞:用鑷子輕輕取出蓋片→PBS/Hanks漂洗2~3次注:漂洗的目的是去除血清和附著于細(xì)胞表面的殘?jiān)乐蛊浞恋K染色。第六十八頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt常用(chánɡyònɡ)固定液簡(jiǎn)單固定液:甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、戊二醛、苦味酸、重鉻酸鉀、鋨酸等混合固定液:甲醇/醋酸固定液、FAA固定液、Carnoy固定液、Bouin固定液、4%多聚甲醛-PBS固定液等甲醇/醋酸固定液:甲醇:冰醋酸為3:1,現(xiàn)用現(xiàn)配,適用于Giemsa染色。FAA固定液:90mL80%酒精+5mL冰乙酸+5mL40%甲醛,適用于蓋片單層培養(yǎng)的細(xì)胞,固定效果(xiàoguǒ)好。Carnoy固定液:較好的非水溶性固定液,60mL純酒精+30mL氯仿+10mL冰乙酸,適用于顯示細(xì)胞化學(xué)成分。第六十九頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt2、細(xì)胞(xìbāo)常用的染色方法H.E(蘇木精-伊紅)染色法原理:堿性染料蘇木精和酸性染料伊紅分別與細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)發(fā)生反應(yīng)(fǎnyìng),使細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)通過(guò)顏色而改變它的折射率,從而在光鏡下能清晰地呈現(xiàn)出細(xì)胞的圖像,并能提供良好的核漿對(duì)比染色。染色結(jié)果:細(xì)胞核染成紅色,細(xì)胞質(zhì)染成藍(lán)色。第七十頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)涂片或細(xì)胞(xìbāo)甩片的HE染色細(xì)胞涂片或細(xì)胞甩片的制備:對(duì)于貼壁細(xì)胞,可將蓋玻片放于培養(yǎng)器皿中,讓培養(yǎng)細(xì)胞長(zhǎng)于玻片上,然后用藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后取出,用4%多聚甲醛固定5min。對(duì)于懸浮細(xì)胞,用藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后,離心(líxīn)1000r/min收集細(xì)胞,用PBS洗2次,收集調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1X105/ml,涂片或用離心甩片,用4%多聚甲醛固定5min;蘇木素染色5min,用流水沖洗;鹽酸乙醇分化30秒;自來(lái)水浸泡15min;伊紅染色2min脫水,透明及封片按以下步驟:95%乙醇(I)1min,95%乙醇(II)1min,100%乙醇(I)1min,100%乙醇(II)1min,二甲苯石碳酸(3∶1)1min,二甲苯(I)1min,二甲苯(II)1min,中性樹(shù)膠封片;第七十一頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt第七十二頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選pptGiemsa(吉姆薩)染色法母液配制:Giemsa粉0.5g,甘油22mL,將Giemsa粉置于研缽內(nèi)先用少量甘油與之充分混合,研磨至無(wú)顆粒;然后將剩余甘油混在一起,56℃保溫2h后,加入33mL純甲醇,混勻,即為Giemsa母液,保存于棕色瓶?jī)?nèi)。染液配制:取9份pH6.8~7.38的Sorensen緩沖液和1份Giemsa母液混合即可。染色步驟:細(xì)胞標(biāo)本用甲醇/醋酸固定液固定30min后,用滴管把染液布滿玻片上,染色10~15min,用自來(lái)水沖去多余染液,空氣干燥,二甲苯同名,光學(xué)樹(shù)脂封固。染色結(jié)果:細(xì)胞核染成紅色,細(xì)胞質(zhì)染成藍(lán)色。注意事項(xiàng):染液宜現(xiàn)配現(xiàn)用,保存時(shí)間最好不用超過(guò)(chāoguò)48h,Giemsa對(duì)pH極敏感,緩沖液pH要調(diào)準(zhǔn)確。第七十三頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt第七十四頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt第七十五頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt瑞氏染色(rǎnsè)觀察【材料與試劑】Wright染液:稱(chēng)取Wright粉劑0.1g在碾缽內(nèi),充分碾磨,量取甲醇60ml,逐步加入,邊加邊碾磨,直到染料全部溶解,置試劑瓶中密封,1周后可用。Wright磷酸鹽緩沖稀釋液:Wright染液10ml,磷酸鹽緩沖液20ml。磷酸鹽緩沖液:磷酸二氫鉀6.63g,磷酸氫二鈉2.56g,蒸餾水1000ml。染色缸,離心涂片機(jī),離心機(jī),顯微鏡。其它:甲醇,0.08%醋酸(cùsuān),中性樹(shù)膠?!静僮鞣椒ā渴占?xì)胞(1×106),PBS洗1次;將以上細(xì)胞涂片或用離心甩片機(jī)制成細(xì)胞甩片;用甲醇固定3~5min;將標(biāo)本玻片插入Wright染液缸中染色2min;再插入Wright磷酸緩沖稀釋液染色4~10min,用蒸餾水沖洗。如果顏色太深,可用0.08%醋酸分化數(shù)秒鐘;晾干,用中性樹(shù)膠封片;【結(jié)果判斷】

正常細(xì)胞核染成深藍(lán)色或藍(lán)紫色,色澤均一,第七十六頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt3、細(xì)胞(xìbāo)特殊的染色方法Feulgen染色法Coomassie染色法PAS反應(yīng)(fǎnyìng)法油紅O(oilredO)法免疫熒光染色法免疫酶染色法第七十七頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選pptFeulgen(福爾根)染色法原理:在60℃條件下,DNA分子中的嘌呤堿和脫氧核糖的連鍵可被1mol/L鹽酸水解打開(kāi),游離出的脫氧核糖醛基能與希夫(Schiff)試劑結(jié)合,形成紫紅色復(fù)合物。在此過(guò)程中,RNA不受影響,故染色具DNA特異性。準(zhǔn)確的溫度(wēndù)和鹽酸濃度,適宜的水溫、時(shí)間是成功的關(guān)鍵。水溫過(guò)度或不足均降低染色強(qiáng)度。

此法能對(duì)DNA進(jìn)行特異性染色試劑配制:1mol/LHCL:濃HCL8.5ml+蒸餾水91.5mlSchiff試劑:母液裝入棕色瓶,蓋緊,黑紙包裹置于暗處

染色過(guò)程:選用Carnoy固定液染色結(jié)果:細(xì)胞核染成粉紅色至紫紅色,胞質(zhì)為無(wú)色。第七十八頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt第七十九頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt考馬斯亮藍(lán)(Coomassie,BB)染色法原理:顯示細(xì)胞骨架、細(xì)胞內(nèi)微絲的染色方法試劑配制:固定液:0.1mol/LNaH2PO4·2H2O14.0mL+0.1mol/LNa2HPO4·12H2O36.0mL+蒸餾水50.9mL+25%戊二醛50.0mL染色液:甲醇46.5mL+冰醋酸7.0mL+考馬斯亮藍(lán)0.02g染色過(guò)程(guòchéng):染色結(jié)構(gòu):細(xì)胞內(nèi)的微絲呈現(xiàn)藍(lán)色。第八十頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt第八十一頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt過(guò)碘酸席夫反應(yīng)(fǎnyìng)法

(periodicacidSchiffreaction,PAS)

原理:過(guò)碘酸是一種強(qiáng)氧化劑,能將葡萄糖的乙二醇基(CHOH-CHOH)氧化成兩個(gè)游離的醛基,它們與Schiff試劑反應(yīng)生成紫紅色產(chǎn)物。

細(xì)胞內(nèi)糖類(lèi)的染色方法(fāngfǎ)試劑配制:染色過(guò)程:染色結(jié)果:細(xì)胞含糖原區(qū)呈紫紅色。第八十二頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt第八十三頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt細(xì)胞內(nèi)脂類(lèi)的染色(rǎnsè)方法蘇丹(sūdān)(Sudan)Ⅲ/Ⅳ法蘇丹黑法Lillie油紅O(oilredO)法Cain硫酸尼羅藍(lán)(Nile)法鋨酸(osmicacid)法第八十四頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt第八十五頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt第八十六頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt油紅O(oilredO)法優(yōu)點(diǎn):油紅O染色的脂肪比蘇丹Ⅲ法染的顏色要深,對(duì)微小的脂滴易于顯示(xiǎnshì),而且沉淀較少。

10%中性甲醛溶液的配制﹙pH7.0﹚:量取37%~40%甲醛20mL,蒸餾水180mL,加入0.8g磷酸二氫鈉﹙NaH2PO4·H2O﹚、1.3g磷酸氫二鈉﹙Na2HPO4﹚,配制成200mL10%中性甲醛溶液,密封備用。第八十七頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt第八十八頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt一.免疫熒光細(xì)胞(xìbāo)化學(xué)技術(shù)

免疫熒光技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性和敏感性與顯微顯示的精確性相結(jié)合。用已知的抗體在不影響其免疫學(xué)特性的前提下與熒光素相結(jié)合。然后將結(jié)合了熒光素標(biāo)記的抗體作為一種標(biāo)準(zhǔn)試劑。對(duì)被檢細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)和鑒定(jiàndìng)。并在熒光顯微鏡下采用一定波長(zhǎng)的熒光,可以直接觀察被檢測(cè)中有否特異熒光的表達(dá)。目前用于標(biāo)記抗體的熒光素主要有異硫氰酸熒光黃(FITC)、四乙基羅丹明(RB200)、四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)及藻紅蛋白(PE)在流式細(xì)胞術(shù)(FCM)中較常用。較為經(jīng)典的方法有下列幾種:第八十九頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt(一)直接法是以熒光標(biāo)記抗體直接與被檢標(biāo)本內(nèi)的抗原反應(yīng)。依據(jù)熒光出現(xiàn)(chūxiàn)的位置及強(qiáng)弱對(duì)被檢細(xì)胞做出判別。該法的優(yōu)點(diǎn)為簡(jiǎn)單特異。但其缺點(diǎn)也很明顯即敏感性較低另需制備大量特異性的熒光抗體。(二)間接法間接法采用抗球蛋白試驗(yàn)原理,先制成熒光素標(biāo)記抗抗體。檢測(cè)中先將特異性抗體與被檢標(biāo)本作用一定的時(shí)間后,充分洗去未結(jié)合的游離特異性抗體,然后添加熒光素標(biāo)記抗抗體使之形成被檢抗原-抗體-熒光素標(biāo)記抗抗體復(fù)合物,由此顯示特異熒光并因復(fù)合物上帶有較多熒光標(biāo)志物,所以其敏感性比直接法要高。第九十頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt組織(zǔzhī)切片組織(zǔzhī)切片直接(zhíjiē)法間接法Ab1-熒光Ab1Ab2-熒光免疫熒光法原理圖第九十一頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt(三)補(bǔ)體法這是一種(yīzhǒnɡ)間接法的改良。既在抗原抗體反應(yīng)時(shí)加入補(bǔ)體,然后再與熒光素標(biāo)記的抗補(bǔ)體抗體結(jié)合形成抗原-抗體-抗補(bǔ)體熒光抗體復(fù)合物。此法敏感性較高。但其較易出現(xiàn)非特異性染色,而且操作過(guò)程相對(duì)較復(fù)雜。(四)雙標(biāo)記法運(yùn)用兩種熒光素在不同的激發(fā)光下顯示不同顏色的特點(diǎn),將不同熒光素分別標(biāo)記所需的特異性抗體??稍谕粯?biāo)本上測(cè)定不同的抗原。此法即可采用直接法也可用間接法進(jìn)行。若分別采用兔源性和鼠源性等不同種屬的抗體,甚至可進(jìn)行三重或多重標(biāo)記法。第九十二頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt加入3%多聚甲醛固定(gùdìng)細(xì)胞,固定(gùdìng)30min后棄去。PBS洗滌3次,每次5min。加5%Tritoon-X100室溫溫和震蕩15min,PBS洗滌3次,每次5min。室溫下,加1%山羊血清封閉1h,同時(shí)在水平搖床溫和振蕩孵育。以1:200比例加入一抗,室溫下振蕩孵育1h,PBST洗滌3次,每次5min。以1:200比例加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗,室溫下振蕩孵育1h,PBST洗滌3次,每次5min。最后加入DAPI(1:1000)進(jìn)行核染色5min,PBS洗滌1次,立即到熒光顯微鏡下觀察。第九十三頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt第九十四頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt單色熒光(yíngguāng)染色第九十五頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt雙色熒光(yíngguāng)染色第九十六頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt多色熒光(yíngguāng)染色第九十七頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt第九十八頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt二、免疫酶細(xì)胞(xìbāo)化學(xué)技術(shù)

免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是將抗原-抗體反應(yīng)的特異性與酶的高效,快速催化作用彼此結(jié)合,由此形成一種既具有免疫熒光、放射免疫的優(yōu)點(diǎn),又避免了他們的缺點(diǎn)。這項(xiàng)技術(shù)的原理和操作與熒光法有許多相似之處,所不同的是用酶來(lái)替代熒光素作為標(biāo)志物,并采用底物被酶分解后的顯色反應(yīng)來(lái)顯示抗原抗體的結(jié)合與否。選用的標(biāo)記酶有辣根過(guò)氧化物酶HRP、堿性磷酸酶(AP)、葡萄糖氧化酶(GOD)、β-D半乳糖苷酶(β-D-Gal)等。以上這些酶因其純度和活性及產(chǎn)品性質(zhì)相對(duì)較穩(wěn)定且部分已制成試劑盒出售(chūshòu)。目前已廣泛地被臨床和實(shí)驗(yàn)室所應(yīng)用第九十九頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt

細(xì)胞二步酶標(biāo)法三步酶標(biāo)法Ab1-酶基團(tuán)(jītuán)Ab1Ab2-酶基團(tuán)(jītuán)免疫酶標(biāo)法原理圖第一百頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt(一)

辣根過(guò)氧化酶免疫(miǎnyì)酶標(biāo)記法

辣根過(guò)氧化酶是從辣根中提取的一種糖蛋白,其作用底物為供氫體和過(guò)氧化物。目前常用的供氫體為二氨基聯(lián)苯胺(DAB)。在酶反應(yīng)過(guò)程(guòchéng)中DAB不斷供給復(fù)發(fā)物電子,使其成為在光鏡下能觀察到的不溶性深棕色多聚合物。定位與酶活力處即抗原-抗體反應(yīng)部分?,F(xiàn)常用的方法有---直接法;間接法;抗體-橋聯(lián)法;過(guò)氧化酶-抗-過(guò)氧化酶復(fù)合物法(PAP);親和素-生物素-過(guò)氧化酶復(fù)合物法(ABC)等。在組織細(xì)胞相關(guān)抗原檢測(cè)中通常使用PAP法和ABC法這兩種。第一百零一頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt第一百零二頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt(二)免疫堿性磷酸酶標(biāo)記法堿性磷酸酶是一種磷酸酯的水解酶。從大腸桿菌中提取的此酶最適PH為8.0左右。其作用的底物有磷酸萘酚AS-MX和磷酸萘酚AS-BI,顯色的偶聯(lián)劑可采用固紅-GBC和固藍(lán)-BB等。免疫堿性磷酸酶染色方法(fāngfǎ)很多,有直接法;間接法;APAAP法;ABC-AP法;但APAAP法和ABC-AP法二種,較為常用,且這二種方法(fāngfǎ)其敏感性和特異性均較滿意。第一百零三頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt在被檢細(xì)胞(xìbāo)周?chē)?或細(xì)胞(xìbāo)內(nèi))見(jiàn)到紅色沉淀物,即為陽(yáng)性反應(yīng)CD13+第一百零四頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選ppt免疫酶橋聯(lián)(APAAP)法染色(rǎnsè)原理細(xì)胞(xìbāo)Ab-1(Mo)Ab-2(Ho)Ab-3(Mo)第一百零五頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選pptAPAAP步驟(bùzhòu)1、固定細(xì)胞(冰凍切片或細(xì)胞涂片不需抗原修復(fù))。2、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶(198毫升甲醇或水+2毫升30%H2O2)室溫(shìwēn)20分鐘。水洗。3、滴加正常血清37℃,30分鐘。4、適當(dāng)稀釋的特異性抗體,37℃60分鐘,或4℃過(guò)夜。5、TBS或PBS(pH7.2)洗3次。6、甩橋抗體,37℃40分鐘或室溫1小時(shí)。7、TBS或PBS(pH7.2)洗3次。8、滴加適當(dāng)稀釋的APAAP復(fù)合物,37℃30分鐘。9、TBS或PBS(pH7.2)洗3次。10、滴加AKP底物溶液,37℃15——30分鐘,陽(yáng)性結(jié)果顯現(xiàn)清晰后流水沖洗。11、復(fù)染(核固紅或蘇木素或甲基綠)1—2分鐘,常規(guī)沖洗后,封片。第一百零六頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選pptAPAAP法APAAP:屬于非標(biāo)記抗體法,通過(guò)具有高特異性的抗堿性磷酸酶抗體,并在抗酶抗體中加入大量的堿性磷酸酶,使堿性磷酸酶充分結(jié)合在抗酶抗體上,形成可溶性的APAAP復(fù)合物,常用的顯色劑為BCIP/NBT、固紅或固藍(lán)。特點(diǎn)不會(huì)與內(nèi)源性過(guò)氧化物酶反應(yīng),所以背景(bèijǐng)較為干凈,特別適合內(nèi)源性過(guò)氧化物酶較多的組織,如肝、腎。第一百零七頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選pptAb-1細(xì)胞(xìbāo)生物素化二抗ABC復(fù)合物生物素化Biotion(HRP/AP)ABC法染色(rǎnsè) 原理圖卵白(luǎnbái)素(Avidin)第一百零八頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選pptABC法(SP、SABC法步驟(bùzhòu)相同)ABC(avidin-biotincomeplex)卵白素-生物素復(fù)合物法屬于親和免疫組織化學(xué)技術(shù)(jìshù),根據(jù)卵白素-生物素高親和力的生物學(xué)特性。而S-P、SABC是以標(biāo)記了過(guò)氧化物酶的抗生物素蛋白鏈酶素(SA)代替ABC復(fù)合物,但由于SA分子量較小,穿透性較好,反應(yīng)速度較快,敏感性高,復(fù)合物也不需要使用前混合,更為簡(jiǎn)單方便。ABC為三步法,第二抗體為生物素化的IgG(或IgM、IgA等),其中的Fab片段與第一抗體結(jié)合,這就要求與第一抗體相配對(duì),如第一抗體是鼠抗,第二抗體應(yīng)該為抗鼠的(或IgM、IgA等)。由于卵白素和生物素親和力強(qiáng),故ABC較PAP敏感20-40倍。最后通過(guò)復(fù)合物上的過(guò)氧化物酶與顯色反應(yīng)形成有顏色的沉淀物,可用顯微鏡觀察。第一百零九頁(yè),共一百一十七頁(yè)。精選pptABC法步驟(bùzhòu):1、固定細(xì)胞(冰凍切片或細(xì)胞涂片不需抗原(kàngyuán)修復(fù))。2、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶(198毫升甲醇或水+2毫升30%H2O2)室溫20分鐘。水洗。3、抗原修復(fù):蒸餾水洗,放入抗原修復(fù)液(Ph6.0)內(nèi)微波修復(fù)20分鐘,快速冷卻.4、pH7.2TBS緩沖液洗三次。5、滴加正常血清37℃,30分鐘。6、加一抗37℃,30分鐘.pH7.2TBS緩沖液洗三次。7、滴加二抗,37℃,30分鐘,pH7.2TBS緩沖液洗三次。8、滴加ABC復(fù)合物,37℃,反應(yīng)45分鐘。pH

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