子生物學(xué)研究方法(上)-生物大分子操作技術(shù)

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2第五章分子生物學(xué)研究法〔上〕——DNA、RNA及蛋白質(zhì)操作技術(shù)2023/7/32南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院3第五章分子生物學(xué)研究法〔上〕2023/7/33南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 從20世紀(jì)中葉開始，分子生物學(xué)研究得到高速開展，主要原因之一是研究方法，特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進(jìn)步。 基因操作主要包括DNA分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因人工合成、定點(diǎn)突變和PCR擴(kuò)增等，是分子生物學(xué)研究的核心技術(shù)。2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院4第五章分子生物學(xué)研究法〔上〕2023/7/34南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進(jìn)入原先沒有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達(dá)?；蚬こ碳夹g(shù)是核酸操作技術(shù)的一局部，只不過它強(qiáng)調(diào)了外源核酸分子在另一種不同的寄主細(xì)胞中的繁衍與性狀表達(dá)。事實(shí)上，這種跨越物種屏障、把來自其它生物的基因置于新的寄主生物細(xì)胞之中的能力，是基因工程技術(shù)區(qū)別于其它技術(shù)的根本特征。2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院5第五章分子生物學(xué)研究法〔上〕內(nèi)容：重組DNA技術(shù)回憶DNA根本操作技術(shù)RNA根本操作技術(shù)基因克隆技術(shù)蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)2023/7/35南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院6第一節(jié)重組DNA技術(shù)回憶2023/7/36南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院三大成就40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)根底問題；50年代提示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保存復(fù)制機(jī)制,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題；50年代末至60年代，相繼提出了“中心法那么〞和操縱子學(xué)說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認(rèn)識了遺傳信息的流動和表達(dá)。2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院92023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院91982美、英批準(zhǔn)使用第一例基因工程藥物--胰島素；Sanger等人完成了入噬菌體48,502bp全序列測定。1983

獲得第一例轉(zhuǎn)基因植物。1984

斯坦福大學(xué)獲得關(guān)于重組DNA的專利。1986

GMO首次在環(huán)境中釋放。1988

J.D.Watson出任"人類基因組計(jì)劃"首席科學(xué)家。1989DuPont公司獲得轉(zhuǎn)腫瘤基因小鼠--"Oncomouse"。1992

歐共體35個(gè)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合完成酵母第三染色體全序列測定。1994第一批基因工程西紅柿在美國上市。1996完成了酵母基因組(1.25×107bp)全序列測定。1997英國愛丁堡羅斯林研究所獲得克隆羊。2000完成第一個(gè)高等植物擬南芥的全序列測定。2001完成第一個(gè)人類基因組全序列測定。2004中國科學(xué)家完成家蠶基因組全序列測定。2005中、美、日科學(xué)家聯(lián)合完成基因組全序列測定。2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院10第一節(jié)重組DNA技術(shù)回憶重組DNA的核心是用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶對DNA分子進(jìn)行體外切割和連接。限制性核酸內(nèi)切酶能夠識別DNA上的特定堿基序列并從這個(gè)位點(diǎn)切開DNA分子。第一個(gè)核酸內(nèi)切酶EcoRI是Boyer實(shí)驗(yàn)室在1972年發(fā)現(xiàn)的，它能特異性識別GAATTC序列，將雙鏈DNA分子在這個(gè)位點(diǎn)切開并產(chǎn)生具有粘性末端的小片段。早在1967年，世界上有5家實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)報(bào)道了DNA連接酶。2023/7/310南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院11幾種主要DNA內(nèi)切酶所識別的序列及其酶切末端2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院12

DNA連接酶能把不同的DNA片段連接成一個(gè)整體。a.DNA的粘性末端；b.DNA的平末端；c.化學(xué)合成的具有EcoRI粘性末端的DNA片段。2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院13第一節(jié)重組DNA技術(shù)回憶僅僅能在體外利用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶進(jìn)行DNA的切割和重組，還不能滿足基因工程的要求，只有將它們連接到具備自主復(fù)制能力的DNA分子上，才能在寄主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖。具備自主復(fù)制能力的DNA分子就是分子克隆的載體。病毒、噬菌體和質(zhì)粒等小分子量復(fù)制子都可以作為基因?qū)氲妮d體。獲得了用外源DNA片段和載體分子重組而成的雜種DNA分子后，還必須通過一個(gè)被稱為細(xì)菌轉(zhuǎn)化的過程將其重新導(dǎo)入到寄主細(xì)胞中，才能保證重組DNA分子的增殖2023/7/313南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院14第一節(jié)重組DNA技術(shù)回憶限制性核酸內(nèi)切酶切割DNADNA連接酶生成3′-5′磷酸二酯鍵DNA聚合酶Ⅰ探針標(biāo)記、補(bǔ)平3′末端反轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探針標(biāo)記末端轉(zhuǎn)移酶3′末端多聚尾堿性磷酸酶3′切除末端磷酸基DNA外切酶Ⅲ3′末端切除單核苷酸λ噬菌體DNA外切酶5′末端切除單核苷酸重組DNA實(shí)驗(yàn)中常見的主要工具酶2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院15第二節(jié)DNA操作技術(shù)1.核酸凝膠電泳技術(shù)自從瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠被引入核酸研究以來，按分子量大小別離DNA的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)開展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實(shí)驗(yàn)手段。根本原理：生物大分子在一定pH條件下，通常會帶電荷。將其放置到電場中，就會以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。分子在電場作用下的遷移速度，與電場強(qiáng)度和電泳分子所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與分子的摩擦系數(shù)成反比。摩擦系數(shù)是分子大小、極性及介質(zhì)粘度的函數(shù)。根據(jù)分子大小、構(gòu)型或形狀的差異和帶凈電荷數(shù)，可通過電泳將蛋白質(zhì)或核酸分子混合物中的各種成分彼此別離。2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院16第二節(jié)DNA操作技術(shù)1.核酸凝膠電泳技術(shù)在生理?xiàng)l件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基團(tuán)，呈離子化狀態(tài)，DNA和RNA多核苷酸鏈稱為多聚陰離子，把它們放置在電場當(dāng)中，會向正電極的方向遷移。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。這就是應(yīng)用凝膠電泳技術(shù)別離DNA片段的根本原理。2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院17第二節(jié)DNA操作技術(shù)1.核酸凝膠電泳技術(shù)瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2~50kb之間。聚丙烯酰胺凝膠的分辨范圍為1到1000個(gè)堿基對之間。凝膠濃度的上下影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。在凝膠電泳中，參加溴化乙錠〔EtBr〕染料對核酸分子進(jìn)行染色，然后放置在紫外光下觀察，可靈敏而快捷地檢測出凝膠介質(zhì)中DNA的譜帶部位，即使每條DNA帶中僅含有0.05μg的微量DNA，也可以被清晰地檢測出來。2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院18第二節(jié)DNA操作技術(shù)溴化乙錠染料的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其對DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙錠分子，在紫外光照射下，瓊脂糖凝膠電泳中DNA的條帶便呈現(xiàn)出橘黃色熒光，易于鑒定。2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院19第二節(jié)DNA操作技術(shù)普通的瓊脂糖凝膠電泳，很難別離大于50kb的DNA分子，而要進(jìn)行超大分子研究，要用到脈沖電場凝膠電泳。2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院20第二節(jié)DNA操作技術(shù)2.細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo)DNA分子的增殖所謂細(xì)菌轉(zhuǎn)化，是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來自另一種細(xì)菌菌株的DNA而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫作供體菌株，接受轉(zhuǎn)化DNA的細(xì)菌菌株那么被稱為受體菌株。將快速生長中的大腸桿菌置于經(jīng)0℃預(yù)處理的低滲氯化鈣溶液中，使細(xì)胞膨脹形成原生質(zhì)球，與外源DNA形成粘附在細(xì)胞外表的復(fù)合物。42℃下做短暫熱刺激，復(fù)合物便會被細(xì)胞所吸收。在全培養(yǎng)基中生長一段時(shí)間使轉(zhuǎn)化基因?qū)崿F(xiàn)表達(dá)，就可涂布于選擇性培養(yǎng)基中別離轉(zhuǎn)化子。2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院21第二節(jié)DNA操作技術(shù)2.細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo)DNA分子的增殖細(xì)菌轉(zhuǎn)化方法除了上述的CaCl2還有電擊法，利用電脈沖使細(xì)胞膜穿孔，外源DNA進(jìn)入從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。利用噬菌體顆粒能夠有效將DNA注入到宿主細(xì)胞這一特點(diǎn)，科學(xué)家又創(chuàng)造了DNA分子的體外包裝法。如右圖2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院22第二節(jié)DNA操作技術(shù)3.聚合酶鏈?zhǔn)椒错懢酆厦告準(zhǔn)椒错?，即PCR技術(shù)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法。它可以快速將極微量的目的基因或某一特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)十萬乃至千百萬倍。根本原理：首先將雙鏈DNA分子在臨近沸點(diǎn)的溫度下加熱別離成兩條單鏈DNA分子，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板并利用反響混合物中的四種脫氧核苷三磷酸合成新生的DNA互補(bǔ)鏈。新合成的DNA鏈的起點(diǎn)，由參加到反響混合物中的一對寡核苷酸引物在模板DNA鏈兩端的退火決定的。DNA解鏈(變性)、引物與模板DNA相結(jié)合(退火)、DNA合成(延伸)三步，被不斷重復(fù)。屢次循環(huán)之后，反響混合物中所含有的雙鏈DNA數(shù)，即兩條引物位點(diǎn)之間的DNA區(qū)段的拷貝數(shù)，理論上的最高值是2n。2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院23第二節(jié)DNA操作技術(shù)3.聚合酶鏈?zhǔn)椒错懢唧w過程：首先將含有待擴(kuò)增DNA樣品的反響混合物放置在高溫〔約94℃〕環(huán)境下加熱1min，使雙鏈DNA變性，形成單鏈模板DNA；然后降低反響溫度〔約56℃〕冷卻1min，使引物與兩條單鏈模板DNA發(fā)生退火作用并結(jié)合在靶DNA區(qū)段兩端互補(bǔ)序列位置上；最后，72℃左右保溫1至數(shù)分鐘，在DNA聚合酶的作用下，從引物的3’-端參加脫氧核苷三磷酸，并沿著模板按5’→3’方向延伸，合成新生DNA互補(bǔ)鏈。以上循環(huán)在同一個(gè)PCR管中進(jìn)行。反響物加完后，溫度由PCR儀調(diào)整，程序完成后可以拿到產(chǎn)物。2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院24屢次循環(huán)之后，反響混合物中所含有的雙鏈DNA數(shù)，即兩條引物位點(diǎn)之間的DNA區(qū)段的拷貝數(shù)，理論上的最高值是2n。2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院25第二節(jié)DNA操作技術(shù)4.實(shí)時(shí)定量PCR具體實(shí)時(shí)熒光定量PCR就是通過對PCR擴(kuò)增反響中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實(shí)時(shí)檢測從而實(shí)現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反響中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反響的進(jìn)行，PCR反響產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院26第二節(jié)DNA操作技術(shù)4.實(shí)時(shí)定量PCR一般而言，熒光擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)中的一些重要因素：Ct值。每個(gè)反響管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Ct值與起始模板的關(guān)系，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小?？衫脕碛?jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院27實(shí)時(shí)熒光定量PCR中熒光化學(xué)，熒光定量pcr所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡述如下：TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時(shí)在參加一對引物的同時(shí)參加一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)別離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。SYBR熒光染料：在PCR反響體系中，參加過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院28TaqMan熒光探針SYBR熒光染料2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院29第二節(jié)DNA操作技術(shù)4.基因組DNA文庫的構(gòu)建從生物組織細(xì)胞提取出全部DNA將其切成預(yù)期大小的片段，分別與載體連接，轉(zhuǎn)入受體細(xì)菌或細(xì)胞，形成克隆。這樣每一個(gè)細(xì)胞接受了含有一個(gè)基因組DNA片段與載體連接的重組DNA分子，而且可以繁殖擴(kuò)增，許多細(xì)胞一起組成一個(gè)含有基因組各DNA片段克隆的集合體，就稱為基因組DNA文庫。如果這個(gè)文庫足夠大，能包含該生物基因組DNA全部的序列，就是該生物完整的基因組文庫?；蚪MDNA文庫可用于別離特定的基因片斷、分析特定基因結(jié)構(gòu)、研究基因表達(dá)調(diào)控、還可用于全基因組物理圖譜的構(gòu)建和全基因組序列測定。2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院30基因組DNA文庫的構(gòu)建過程2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院31第三節(jié)RNA操作技術(shù)1.總RNA的提取RNA易遭降解，實(shí)驗(yàn)要求較嚴(yán)格?？俁NA提取的方法有多種，主要有LiCl法、CTAB法、異硫氰酸胍法〔TriZol〕。異硫氰酸胍法〔TriZol〕原理：TRIZOL試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)別離，并將RNA釋放到溶液中。當(dāng)參加氯仿時(shí)，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進(jìn)入水相，離心后可形成水相層和有機(jī)層，這樣RNA與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA別離開。水相層〔無色〕主要為RNA，有機(jī)層〔黃色〕主要為DNA和蛋白質(zhì)。2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院32第三節(jié)RNA操作技術(shù)2.mRNA的純化mRNA的別離方法較多，其中以寡聚〔dT〕-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規(guī)方法。利用mRNA的PolyA結(jié)構(gòu)，試劑盒提供一種生物素化寡聚dT引物，與PolyA雜交，形成生物素化寡聚dT-mRNA的雜交體，然后利用生物素與抗生物素蛋白的結(jié)合作用以鏈抗生物素-順磁顆?！睸A-PMPs〕結(jié)合雜交體，形成生物素化寡聚dT-mRNA-SA-PMPs復(fù)合物，再利用磁性吸附作用以磁性條吸附復(fù)合物中的SA-PMPs顆粒，最后利用高嚴(yán)緊度鹽溶液中分子雜交體磁性減弱，雜交體中生物素化寡聚dT引物與mRNA別離，從而純化得到mRNA。2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院33PolyATtractmRNA的別離純化過程簡圖2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院34第三節(jié)RNA操作技術(shù)3.cDNA的合成cDNA的合成包括第一鏈和第二鏈cDNA的合成。第一鏈cDNA的合成是以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，有反轉(zhuǎn)錄酶催化，該酶合成DNA時(shí)需要引物引導(dǎo)，常用引物是oligodT。第二鏈合成是以第一鏈為模板，由DNA聚合酶催化。2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院35第三節(jié)RNA操作技術(shù)4.cDNA文庫的構(gòu)建cDNA文庫是指某生物某發(fā)育時(shí)期所轉(zhuǎn)錄的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。經(jīng)典cDNA文庫構(gòu)建的根本原理是用Oligo(dT)作逆轉(zhuǎn)錄引物，或者用隨機(jī)引物，給所合成的cDNA加上適當(dāng)?shù)倪B接接頭，連接到適當(dāng)?shù)妮d體中獲得文庫。步驟：在獲得高質(zhì)量的mRNA后，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，合成接頭的參加、將雙鏈DNA克隆到載體中去、分析cDNA插入片斷，擴(kuò)增cDNA文庫、對建立的cDNA文庫進(jìn)行鑒定。這里強(qiáng)調(diào)的是對載體的選擇，常規(guī)用的是λ噬菌體，這是因?yàn)棣薉NA兩端具有由12個(gè)核苷酸的粘性末端，可用來構(gòu)建柯斯質(zhì)粒，這種質(zhì)粒能容納大片段的外源DNA。2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院36第三節(jié)RNA操作技術(shù)5.基因文庫的篩選基因文庫的篩選是指通過某種特殊方法從基因文庫中鑒定出含有所需重組DNA分子的特定克隆的過程。篩選方法有很多種，常用的有：核酸雜交法PCR篩選法免疫篩選法2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院37第四節(jié)基因克隆技術(shù)在多細(xì)胞的高等生物個(gè)體水平上，人們用克隆〔clone〕表示由具有相同基因型的同一物種的兩個(gè)或數(shù)個(gè)個(gè)體組成的群體。從同一受精卵分裂而來的單卵雙生子〔monozygotictwins〕便是屬于同一克隆。在細(xì)胞水平上，克隆一詞是指由同一個(gè)祖細(xì)胞〔progenitorcell〕分裂而來的一群遺傳上同一的子細(xì)胞群體。在分子生物學(xué)上，人們把將外源DNA插入具有復(fù)制能力的載體DNA中，使之得以永久保存和復(fù)制這種過程稱為克隆。2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院38第四節(jié)基因克隆技術(shù)1.RACE技術(shù)是用于從cDNA片段擴(kuò)增全長基因的方法，它根據(jù)序列設(shè)計(jì)基因片段內(nèi)部特異引物，由該片段向外側(cè)進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到目的序列。用于擴(kuò)增5’端的方法稱為5’RACE，用于擴(kuò)增3’端的稱為3’RACE。cDNA序列可來自序列表達(dá)標(biāo)簽、減法cDNA庫、差法顯示和基因文庫篩選。2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院39第四節(jié)基因克隆技術(shù)1.RACE技術(shù)5’RACE在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以基因片段內(nèi)部。特異性引物啟始cDNA第一條鏈的合成RNase混合物降解模板mRNA，純化cDNA第一條鏈。用末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA鏈3‘端參加連續(xù)的dCTP以連有oligo(dG)的錨定引物和基因片段內(nèi)部特異的nested引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以期得到目的片段，并可用nestPCR進(jìn)行檢測。2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院40第四節(jié)基因克隆技術(shù)1.RACE技術(shù)3’RACE是在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以連有可以和polyA配對的oligo(dT)的錨定引物啟始cDNA第一條鏈的合成。用RNaseH降解模板mRNA。用通用錨定引物和基因片段內(nèi)部特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到目的3‘片段，并可用nestPCR的方法繼續(xù)進(jìn)行檢測和擴(kuò)增。2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院41第四節(jié)基因克隆技術(shù)2.應(yīng)用cDNA差示法分析克隆基因cDNA差示分析法〔representationaldifferenceanalysis,RAD〕充分發(fā)揮了PCR能以指數(shù)形式擴(kuò)增雙鏈DNA模板，僅以線形形式擴(kuò)增單鏈模板的特性，通過降低cDNA群體復(fù)雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異性擴(kuò)增目的基因片斷。2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院42第四節(jié)基因克隆技術(shù)3.Gateway大規(guī)?？寺〖夹g(shù)Gateway克隆技術(shù)是利用λ噬菌體與大腸桿菌的染色體之間發(fā)生的位點(diǎn)特異性的重組整合與切出反響。整合反響是由Int〔integrase〕和IHF〔IntegrationHostFactor〕催化的。attB和attP之間的重組整合的噬菌體基因組DNA的5’和3’端含有attL和attR位點(diǎn)。切出的重組反響需要IHF,Int和Xis蛋白的參與。在插入E.coli基因組DNA的的噬菌體基因組DNA的5’和3’端的attL和attR位點(diǎn)發(fā)生位點(diǎn)特異性的重組，重新在形成lambdaDNA的attP位點(diǎn)和E.coli基因組DNA的attB位點(diǎn)。2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院43第四節(jié)基因克隆技術(shù)3.Gateway大規(guī)?？寺〖夹g(shù)相對酶切構(gòu)建載體來說，該技術(shù)具有需時(shí)短、操作簡單、易于各實(shí)驗(yàn)室交流的特點(diǎn)，即只需通過簡單、高效的BP和LR反響就可實(shí)現(xiàn)把PCR產(chǎn)物定向轉(zhuǎn)入克隆質(zhì)粒和表達(dá)質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)PCR產(chǎn)物在各種質(zhì)粒間的轉(zhuǎn)移。2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院44第四節(jié)基因克隆技術(shù)4.基因的圖位克隆法所有具有某種表現(xiàn)型的基因都可通過該法克隆得到。首先，通過構(gòu)建遺傳連鎖圖，將目的基因定位到某染色體的特定位點(diǎn)，并在其兩側(cè)確定緊密連鎖的RFLP或RAPD分子標(biāo)記。通過對許多不同的生態(tài)型及大量限制性內(nèi)切酶和雜交探針的分析，找出與目的基因距離最近的RFLP標(biāo)記，通過染色體步移技術(shù)將位于這兩個(gè)標(biāo)記之間的基因片段克隆并別離出來2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院45第五節(jié)蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù) 蛋白質(zhì)組學(xué)的開展既是技術(shù)所推動的也是受技術(shù)限制的。蛋白質(zhì)組學(xué)研究成功與否，很大程度上取決于其技術(shù)方法水平的上下。蛋白質(zhì)研究技術(shù)遠(yuǎn)比基因技術(shù)復(fù)雜和困難。蛋白質(zhì)組的研究實(shí)質(zhì)上是在細(xì)胞水平上對蛋白質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模的平行別離和分析，往往要同時(shí)處理成千上萬種蛋白質(zhì)。因此，開展高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確性的研究技術(shù)平臺是現(xiàn)在乃至相當(dāng)一段時(shí)間內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的主要任務(wù)。2023/7/3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院46第五節(jié)蛋白質(zhì)組