細(xì)胞工程第7章 干細(xì)胞

第7章

干細(xì)胞

(StemCell)什么是干細(xì)胞(stemcells)干細(xì)胞是具有自我更新(Self-renewal)和分化潛能(Potency)的細(xì)胞。Mouseembryonicstemcellswithfluorescentmarker.HumanEmbryonicStemcellcolonyonmouseembryonicfibroblastfeederlayer.2干細(xì)胞的分類按來源分類胚胎干細(xì)胞成體干細(xì)胞按分化潛能分類

多能干細(xì)胞

全能干細(xì)胞

專能干細(xì)胞

3胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞的比較定義:是從早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(或生殖脊)分離，并經(jīng)體外抑制分化培養(yǎng)所獲得的干細(xì)胞。特點：具有很強的分化能力，可以無限增加，并且可以分化成全身２００多種細(xì)胞類型?？偨Y(jié)：它能長成動物的任何組織和器官成體干細(xì)胞位于成體的組織和器官特點：在特定條件下，成體干細(xì)胞或者產(chǎn)生新的干細(xì)胞，或者按一定的程序進(jìn)行分化，形成新的功能細(xì)胞，從而使組織和器官保持生長和衰退的動態(tài)平衡。

4美國威斯康辛大學(xué)（UniversityofWisconsin）科學(xué)家湯姆森（JamesA.Thomson）帶領(lǐng)研究團(tuán)隊首次從人類胚胎組織中提取培養(yǎng)出胚胎干細(xì)胞（EmbryonicStemCell，ESCell）株，并且證實此株細(xì)胞具有全能干細(xì)胞特征，此項研究論文發(fā)表在1998年11月6日出版的頂級學(xué)術(shù)期刊Science上.這篇論文標(biāo)著著一個時代的到來，而湯姆森也被人稱作"干細(xì)胞研究之父"。JamesA.Thomsonthomson@5

1999年12月，美國《科學(xué)》雜志公布了當(dāng)年世界科學(xué)進(jìn)展的評定結(jié)果，干細(xì)胞的研究成果列在舉世矚目耗資巨大的人類基因組工程之前，名列十大科學(xué)進(jìn)展首位。

67.1胚胎干細(xì)胞

（embryonicstemcells,ES細(xì)胞）

四個基本問題:什么是ES細(xì)胞？（定義）如何分離培養(yǎng)ES細(xì)胞（建系）如何鑒定ES細(xì)胞？ES細(xì)胞有何應(yīng)用價值？7

受精卵裂受精后72h受精后5-7天精子+卵子

合子卵裂球桑椹胚囊胚滋養(yǎng)層胎盤及胎兒附屬結(jié)構(gòu)囊胚內(nèi)胚層消化道、呼吸道上皮和腺體；肝；膽；胰。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中胚層結(jié)締組織；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系統(tǒng)外胚層體表結(jié)構(gòu)；神經(jīng)系統(tǒng)人早期胚胎發(fā)育8胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcells,ES細(xì)胞）胚胎生殖細(xì)胞（embryonicgermcells,EG細(xì)胞）97.1.1胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)特性參見7.1.3ES細(xì)胞的鑒定10獲取早期發(fā)育胚胎分離囊胚的內(nèi)細(xì)胞群ES細(xì)胞體外培養(yǎng)，細(xì)胞非分化增殖ES細(xì)胞的鑒定ES的傳代和凍存7.1.2胚胎干細(xì)胞的建系建系步驟：11（1）細(xì)胞形態(tài)特征、取材部位（2）細(xì)胞表面的特殊標(biāo)志（3）細(xì)胞內(nèi)干細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá)（4）端粒酶（5）核型分析體內(nèi)分化（6）分化潛能

體外分化嵌合體:利用ES細(xì)胞可以獲得具有來自兩個或多個合子體細(xì)胞的個體，又叫鑲嵌體7.1.3

胚胎干細(xì)胞的鑒定12形態(tài)學(xué)鑒定：典型的ES細(xì)胞體積較小，有一個大核，核內(nèi)有一個或多個明顯的核仁，胞質(zhì)較少。細(xì)胞之間界限不清晰，緊密聚集呈鳥巢狀克隆。

13胚胎干細(xì)胞的特性14分化能力檢測ES細(xì)胞具有發(fā)育全能性，這是其區(qū)別于其它細(xì)胞的顯著特點。ES細(xì)胞一旦脫離飼養(yǎng)層或除去分化抑制物后進(jìn)行培養(yǎng)，會自發(fā)分化為多種細(xì)胞。在某些物質(zhì)的誘導(dǎo)下，一些特定基因的表達(dá)變化，從而使ES細(xì)胞發(fā)生定向分化。15分化能力檢測①體外分化試驗：將所培養(yǎng)的細(xì)胞制成懸液在鋪有明膠的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，則貼壁生長的ES細(xì)胞會自發(fā)地分化為各種細(xì)胞，而懸浮生長的ES細(xì)胞會形成簡單類胚體，然后進(jìn)一步形成囊狀胚體。②體內(nèi)分化試驗：將一定量培養(yǎng)的ES細(xì)胞注入同源動物的皮下，過一段時間后會形成組織瘤，且組織瘤內(nèi)有三個胚層的細(xì)胞存在。③核移植檢測：將培養(yǎng)的細(xì)胞作為核供體注入去核卵母細(xì)胞中，觀察重構(gòu)胚是否正常發(fā)育。④嵌合體形成檢測：將培養(yǎng)的細(xì)胞與受體胚胎結(jié)合并移植入同期假孕受體，ES細(xì)胞可參與受體胚胎的發(fā)育從而得到嵌合體動物，然后通過毛色判斷，或同工酶檢測。16（1）加入誘導(dǎo)細(xì)胞分化的因子或化學(xué)物質(zhì)，如VGEF、bFGF、DMSO和RA等（2）將ES細(xì)胞與特定的細(xì)胞共培養(yǎng)（3）將某種分化誘導(dǎo)因子的基因轉(zhuǎn)入ES細(xì)胞內(nèi)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的常用方法17胚胎干細(xì)胞的體外定向誘導(dǎo)分化：

胎牛血清，骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－－－－－－造血細(xì)胞

RA胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－－－－－－神經(jīng)細(xì)胞

DMSO胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－－－－－－肌肉細(xì)胞

TGF-B1,VEGF,bFGF胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－－－－－－血管和內(nèi)皮細(xì)胞

RA+胰島素+T3胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－－－－－－脂肪細(xì)胞

BMP-2,BMP-4胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－－－－－－軟骨細(xì)胞

地塞米松，磷酸甘油胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－－－－－－骨細(xì)胞

基因轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－－－－－－胰島素分泌細(xì)胞187.1.4ES細(xì)胞的應(yīng)用前景

及面臨的難題胚胎干細(xì)胞研究是把雙刃劍19胚胎干細(xì)胞研究的意義（應(yīng)用前景）研究哺乳動物個體發(fā)生發(fā)育規(guī)律研究細(xì)胞分化研究基因功能生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物治療性克隆研究細(xì)胞癌變機理及新藥物的篩選20胚胎干細(xì)胞+

體細(xì)胞克隆=治療性克隆(therapeuticcloning)21美科學(xué)家使小鼠胚胎干細(xì)胞發(fā)育成為成熟精子

22胚胎干細(xì)胞研究面臨的難題增殖與分化的矛盾潛在致癌機制器官形成困難重重倫理沖突23倫理沖突ES研究也引發(fā)了當(dāng)前最為激烈而敏感的倫理之爭。主要圍繞兩個問題而展開：一是如何看待胚胎。ES主要有三個來:

（1）（自然和人工）流產(chǎn)的胚胎；（2）輔助生殖剩余的胚胎；（3）通過體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移術(shù)得到的胚胎。不管哪一個來源，提取ES必定會損毀胚胎。于是，胚胎是不是生命，是不是人，研究ES是不是“毀滅生命”、“殺人”，很自然地成為爭論的焦點。24如何解決倫理矛盾不破壞胚胎的情況下獲取胚胎干細(xì)胞成體干細(xì)胞橫向分化睪丸細(xì)胞：胚胎干細(xì)胞的新來源iPS252006年8月24日，美國學(xué)者蘭薩領(lǐng)導(dǎo)的研究小組在《自然》雜志發(fā)表文章，宣稱已實現(xiàn)在不破壞胚胎的情況下獲取胚胎干細(xì)胞。這一成果如果得到學(xué)界承認(rèn)，將是這一研究領(lǐng)域的一大進(jìn)步。不再“殺雞取卵”的胚胎干細(xì)胞研究將贏得充分的發(fā)展空間。26成體干細(xì)胞橫向分化已經(jīng)由多項研究證明，之前被認(rèn)為發(fā)展很有限的特定組織中的成體干細(xì)胞在一定的條件下還能夠形成其他組織的細(xì)胞類型，這些發(fā)現(xiàn)為干細(xì)胞新資源的探索和更廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

271自我更新的機理，定向分化的機理2胚胎干細(xì)胞建系（尤為人胚胎干細(xì)胞）3治療性克隆4胚胎干細(xì)胞定向發(fā)育成三維器官5胚胎干細(xì)胞移植的安全性問題胚胎干細(xì)胞的重點研究方向28不同國家、地區(qū)的人胚胎干細(xì)胞研究政策允許或制定靈活的ES研究政策：允許或采取靈活的ES研究政策：澳大利亞，比利時，巴西，加拿大，中國，捷克斯洛伐克，丹麥，愛沙尼亞，芬蘭，法國，希臘，匈牙利，冰島，印度，以色利，日本，拉脫維亞，荷蘭，新西蘭，俄國，新加坡，斯洛文尼亞，南非，韓國，西班牙，瑞典，瑞士，中國臺灣，泰國，英國。嚴(yán)格限制：德國，意大利，香港。完全禁止：奧地利，愛爾蘭，立陶宛，挪威，波蘭。29

7.2成體干細(xì)胞

（Adultstemcell）概念：

成體干細(xì)胞是在成體組織內(nèi)具有自我更新能力并能分化產(chǎn)生一種或一種以上子代組織細(xì)胞的未成熟細(xì)胞。成體干細(xì)胞的特點數(shù)量少，難以識別、分離純化體外培養(yǎng)時不能長時間增殖具有可塑性※（神經(jīng)干細(xì)胞—造血干細(xì)胞）在完全分化前經(jīng)歷一個中間類型即祖細(xì)胞階段※可塑性（plasticity）造血干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等成體干細(xì)胞具有一定跨系、甚至跨胚層分化的特性，稱其為干細(xì)胞的“可塑性”。31成體干細(xì)胞種類造血干細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞精原干細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞表皮干細(xì)胞腸干細(xì)胞肝干細(xì)胞32造血干細(xì)胞

(hematopoieticstemcells，HSCs)

造血干細(xì)胞是從血液、骨髓、臍帶血來源的一群原始造血細(xì)胞，其能自我更新、分化成一些具有組織特化的細(xì)胞，能從骨髓中游離出來進(jìn)入血液循環(huán)、能發(fā)生程序性死亡的細(xì)胞。造血干細(xì)胞是最早發(fā)現(xiàn)，研究最多和最先用于治療疾病的成體干細(xì)胞。造血干細(xì)胞移植是從60年代逐漸發(fā)展起來的一種醫(yī)療技術(shù)，由于最初是通過抽取供體骨髓而獲得造血干細(xì)胞,所以又稱為骨髓移植。近10年來，由于科學(xué)的進(jìn)步，人們已可通過一些藥物將骨髓中的造血干細(xì)胞動員到外周血中，通過血細(xì)胞分離機分取造血干細(xì)胞，稱為外周血干細(xì)胞移植。造血干細(xì)胞34三個部位生產(chǎn)/存儲造血干細(xì)胞大部分在骨髓里，即骨髓造血干細(xì)胞。在外周血液中，也就是在血管里面有少量的造血干細(xì)胞。在臍帶里有豐富的造血干細(xì)胞。

骨髓；1/400

外周血；1/100000

臍帶血；1/10000

造血干細(xì)胞的來源35

造血干細(xì)胞的分離和鑒定免疫吸附法（抗原和抗體特異性結(jié)合）磁性標(biāo)記CD34單克隆抗體加入供體外周血抗原和抗體特異性結(jié)合通過分選系統(tǒng)造血干細(xì)胞吸附到柱子上其他細(xì)胞留在血液中造血干細(xì)胞的應(yīng)用造血干細(xì)胞移植可以治療多種血液病、實體瘤、免疫缺陷病和重度急性放射病，這已被很多人所熟悉?；蛑委?造血干細(xì)胞以其自我復(fù)制和分化潛能的特點,成為基因治療最理想的靶細(xì)胞之一?？茖W(xué)家們在對造血干細(xì)胞的研究中還取得了許多新進(jìn)展并發(fā)現(xiàn)許多新功能，研究結(jié)果表明造血干細(xì)胞具有可塑性，可以轉(zhuǎn)變?yōu)檠?、肝臟、脂肪、神經(jīng)、肌肉等組織細(xì)胞，并深入探討了造血干細(xì)胞治療冠心病、神經(jīng)損傷、血管閉塞性疾病等方面的新應(yīng)用。

37骨髓移植技術(shù)使眾多白細(xì)胞患者得到救治，使急性白血病患者的長期生存率提高到50%-70%。為發(fā)展此項技術(shù)做出了重要貢獻(xiàn)的美國醫(yī)學(xué)家托馬斯因而獲得了1990年度的諾貝爾醫(yī)學(xué)獎。1976年托馬斯報道100例晚期白血病病人經(jīng)HLA相合同胞的骨髓移植后，13例奇跡般長期生存。從此全世界應(yīng)用骨髓移植治療白血病，再生障礙性貧血及其他嚴(yán)重血液病，嚴(yán)重血液功能缺陷病，急性放射病，部分惡性腫瘤等方面取得巨大成功，開創(chuàng)臨床治療白血病及惡性腫瘤的新紀(jì)元。骨髓移植中國骨髓移植奠基人陸道培教授于1964年在亞洲首先成功開展了異體(同基因)骨髓移植38眾多實驗表明，人臍帶血中含有大量早期造血干細(xì)胞。體外培養(yǎng)中，其增殖能力及生存時間均優(yōu)于骨髓造血細(xì)胞，臍血中淋巴細(xì)胞亦有與成人外周血不同的生物學(xué)特征，主要表現(xiàn)為發(fā)育上更原始，抗原表達(dá)及增殖性應(yīng)簽反應(yīng)較弱迄今，均臍血干細(xì)胞移植已廣泛應(yīng)用于多種惡性和非惡性疾病的治療，結(jié)果令人鼓舞。目前，許多國家都在積極著手建立臍血庫。臍血