菌種選育方法

關(guān)于菌種選育方法1第1頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三22.2菌種選育主要內(nèi)容自然選育誘變育種抗噬菌體菌株的選育雜交育種原生質(zhì)體融合技術(shù)DNA重組技術(shù)菌種保藏第2頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三3經(jīng)典育種：自然選育誘變育種帶有一定的盲目性，尚屬于經(jīng)典育種的范疇。定向育種：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、原生質(zhì)體融合、代謝調(diào)控和基因工程等較為定向的育種方法。國內(nèi)這些方法成功地用在生產(chǎn)上的例子較少，發(fā)達(dá)國家比較普遍育種方法第3頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三42.2.1自然選育自然選育自然突變自然分離第4頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三51自然選育自然選育：不經(jīng)過人工處理，利用菌種的自然突變(spontaneousMutation)而進(jìn)行菌種篩選的過程叫做自然選育。自然突變：是指某些微生物在沒有人工參與下所發(fā)生的那些突變。自然突變的原因自然突變的頻率正突變和負(fù)突變第5頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三62自然突變的原因多因素低劑量的誘變效應(yīng)多因素低劑量的誘變效應(yīng)：由一些原因不詳?shù)牡蛣┝空T變因素引起的長期綜合效應(yīng)，例如充滿宇宙空間的各種短波輻射、自然界中普遍存在的一些低濃度誘變物質(zhì)以及微生物自身代謝活動(dòng)中所產(chǎn)生的一些誘變物質(zhì)(如過氧化氫)的作用等?；プ儺悩?gòu)效應(yīng)第6頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三7四種堿基的第六位上的酮基和氨基，胸腺嘧啶(T)和鳥嘌呤(G)可以酮式或烯醇式出現(xiàn)，胞嘧啶(C)和腺瞟呤(A)可以氨基式或亞氨基式出現(xiàn)。平衡一般傾向于酮式和氨基式，因此，在DNA雙鏈結(jié)構(gòu)中以AT和GC堿基對(duì)為主?？墒窃谂既磺闆r下T也會(huì)以稀有的烯醇式形式出現(xiàn)，因而在DNA復(fù)制到達(dá)這一位置的一瞬間，通過DNA多聚酶的作用，在它的相對(duì)位置上就不出現(xiàn)A而出現(xiàn)G。如果C以稀有的亞氨基形式出現(xiàn)，在新合成的DNA單鏈的相對(duì)位置上就將是A而不是G。自然突變-互變異構(gòu)效應(yīng)第7頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三8互變異構(gòu)效應(yīng)-可以被誘變劑激發(fā)第8頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三9間接引起置換的誘變劑:5-溴尿嘧啶（5-BU）

5-BU是T的代謝類似物。當(dāng)把某一微生物培養(yǎng)在含5-BU的培養(yǎng)液中時(shí)，細(xì)胞中有一部分新合成的DNA的T就被5-BU所取代。5-BU一般以酮式狀態(tài)存在于DNA中，因而仍可正常地與A配對(duì)，這時(shí)并未發(fā)生堿基對(duì)的轉(zhuǎn)換。有時(shí)5-BU會(huì)以烯醇式狀態(tài)出現(xiàn)在DNA中，于是當(dāng)DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí)，在其相對(duì)位置上出現(xiàn)的就是G，而不是原來的A，因而引起了堿基對(duì)從原來的A︰T變至G┇C的轉(zhuǎn)換。第9頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三105-BU在以酮式或烯醇式狀態(tài)存在時(shí)引起的A︰T→G┇C的轉(zhuǎn)換

A:T

G:CA:TA:BukG:BueG:CG:BueA:TG:CA:BukA:BUG:C

A:TA:BU第10頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三11堿基的置換直接引起置換的誘變劑HNO2CNH2腺嘌呤CO次黃嘌呤(Hk)A..THe..THk..

THk..

CA..THk..

CG..

CCOH次黃嘌呤(He)第11頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三12大量統(tǒng)計(jì)分析后，發(fā)現(xiàn)堿基對(duì)發(fā)生自然突變的機(jī)率約為10-8-10-9。自然突變有兩種情況：一種是生產(chǎn)上所不希望有的，表現(xiàn)為菌種的衰退和生產(chǎn)質(zhì)量的下降，稱為負(fù)突變；另一種是對(duì)生產(chǎn)有益的，表現(xiàn)為菌株生產(chǎn)性能的上升，稱為正突變。自然突變的頻率，正突變和負(fù)突變第12頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三133自然分離自然分離:生產(chǎn)菌株經(jīng)過一定時(shí)期的使用后須純化，淘汰衰退的；保存優(yōu)良的菌種。從高生產(chǎn)水平批號(hào)中取樣進(jìn)行單菌落分離，從中選出比較穩(wěn)定的菌株，用于生產(chǎn)。突變株自然分離:經(jīng)誘變的突變株會(huì)繼續(xù)發(fā)生變異。其結(jié)果往往導(dǎo)致菌株不同類型的比例的改變，而低單位菌株在傳代過程中往往占優(yōu)勢，必須進(jìn)行自然分離。第13頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三14自然選育簡單易行，可以純化菌種，防止菌種衰退、穩(wěn)定生產(chǎn)、提高產(chǎn)量。缺點(diǎn)是效率低、進(jìn)展慢。自然選育和誘變育種交替使用，效果好。自然選育(自然分離)的一般程序把菌種制備成單孢子懸浮液，經(jīng)過適當(dāng)?shù)南♂屢院?，在固體平板上進(jìn)行分離，挑取部分單菌落進(jìn)行生產(chǎn)能力的測定，經(jīng)反復(fù)篩選，以確定生產(chǎn)能力更高的菌株代替原來的菌株。自然分離第14頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三152.2.2誘變育種誘變育種的基本原理誘變育種的一般步驟誘變育種工作中幾個(gè)應(yīng)該注意的問題幾種物理、化學(xué)誘變劑的使用方法第15頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三161誘變育種的基本原理誘變育種的理論基礎(chǔ)是基因突變，所謂突變是指由于染色體和基因本身的變化而產(chǎn)生的遺傳性狀的變異。染色體畸變和基因突變。染色體畸變（chromosomalaberration)：是指染色體或DNA片斷的插入（insertion)、缺失(deletion)、易位(translocation)、倒位(inversion)、重復(fù)(duplication)等?；蛲蛔?genemutation)：是指DNA分子結(jié)構(gòu)中的一對(duì)或幾對(duì)堿基發(fā)生變化(又稱點(diǎn)突變)。第16頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三17倒置易位缺失點(diǎn)突變突變類型第17頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三18突變發(fā)生的原因可分為自然突變和誘發(fā)突變。自然突變是指在自然條件下出現(xiàn)的基因突變誘發(fā)突變是指用各種物理、化學(xué)因素人工誘發(fā)的基因突變。誘變因素有物理的、化學(xué)的和生物的三大類，見表6-1。第18頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三19常用誘變劑及其類別第19頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三20從Watson和Crick的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型中可看出，雖然兩條單鏈之間的堿基受著互補(bǔ)規(guī)律的制約(即A必須和T，C必須和G配對(duì))，但就一條單鏈來說四種堿基的排列順序是不受限制的。DNA的多樣性即堿基排列方式的多樣性是遺傳性千差萬異的內(nèi)在原因。突變發(fā)生的原因第20頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三21第21頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三222誘變育種的一般步驟誘變育種整個(gè)流程主要是誘變和篩選兩部分。誘變：包括由出發(fā)菌株開始，制出新鮮孢子懸浮液（或細(xì)菌懸液）經(jīng)過誘變處理以后以一定稀釋涂平板，至平板上長出單菌落等各步驟。誘發(fā)所形成的突變與菌種本身的遺傳背景、誘變劑種類及其劑量的選擇和合理使用方法均有密切關(guān)系。第22頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三23誘變育種篩選：包括經(jīng)單孢子分離長出單菌落后隨機(jī)挑至斜面，經(jīng)初篩和復(fù)篩進(jìn)行生產(chǎn)能力測定和菌種保存(即將篩選出來的高產(chǎn)菌種保藏好)。誘變育種的整個(gè)過程主要是誘變和篩選的不斷重復(fù)，直到獲得比較理想的高產(chǎn)菌株。第23頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三24誘變育種的一般步驟第24頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三253誘變育種應(yīng)該注意的問題選擇好出發(fā)菌株：產(chǎn)量高、對(duì)誘變劑敏感性大、變異幅度廣。復(fù)合誘變因素的使用：對(duì)野生型菌株，單一誘變因素有時(shí)也能取得好的效果，但對(duì)老菌種，單一誘變因素重復(fù)使用突變的效果不高，這時(shí)可利用復(fù)合因素來擴(kuò)大誘變幅度，提高誘變效果。劑量選擇：凡既能增加變異幅度又能促使變異向正變范圍移動(dòng)的劑量就是合適的劑量。變異菌株的篩選：營養(yǎng)缺陷型、抗反饋抑制/阻遏、組成型高產(chǎn)菌株的篩選需要篩選條件的配合第25頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三264誘變劑的使用方法

紫外線快中子氮芥亞硝酸N—甲基-N'硝基—N—亞硝，基胍(NTG)第26頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三27A紫外線紫外線的輻射光源便宜，危險(xiǎn)性小，誘變效果好，應(yīng)用最廣泛。對(duì)誘變最有效的波長僅僅是260nm左右(253—265nm)一般誘變時(shí)用菌(孢子)懸浮液進(jìn)行處理，紫外燈的功率為15W，距離固定在30cm左右。紫外線的作用機(jī)制：主要是形成胸腺嘧啶二聚體以改變DNA生物活性，造成菌體死亡和變異。第27頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三28紫外線對(duì)DNA的損傷對(duì)紫外線來說，嘧啶要比嘌呤敏感得多。嘧啶的光化產(chǎn)物主要是二聚體和水合物。紫外線的主要作用是使同鏈DNA的相鄰嘧啶間形成共價(jià)結(jié)合的胸腺嘧啶二聚體。二聚體的出現(xiàn)會(huì)減弱雙鏈間氫鍵的作用，并引起雙鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生扭曲變形，阻礙堿基間的正常配對(duì)，從而有可能引起突變或死亡。在互補(bǔ)雙鏈間形成嘧啶二聚體的機(jī)會(huì)較少。但一旦形成，就會(huì)妨礙雙鏈的解開，因而影響了DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，并使細(xì)胞死亡。第28頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三29第29頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三30紫外-NaNO2復(fù)合誘變育種優(yōu)勢菌群紫外線輻射NaNO2處理馴化培養(yǎng)正突變菌株

性狀菌株氧化活性/μLO2·L-1min-1比生長速率/h-1傳代時(shí)間/h在礦物表面吸附平衡時(shí)間/h原始菌0.1－0.130.058-0.1166－1224－28改良菌0.9－1.10.1783.91－7改良菌的性狀遠(yuǎn)優(yōu)于原始菌第30頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三31紫外線對(duì)枯草芽孢桿菌BF7658的誘變效應(yīng)菌懸液的制備（a）取培養(yǎng)48小時(shí)的枯草芽孢桿菌BF7658（產(chǎn)淀粉酶）的斜面4-5支，用無菌生理鹽水將菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角燒瓶中，振蕩30分鐘，以打碎菌塊。（b）將上述菌液離心（3000r/min，離心15分鐘），棄去上清液，將菌體用無菌生理鹽水洗滌2-3次，最后制成菌懸液。（c）用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升108個(gè)。平板制作將淀粉瓊脂培養(yǎng)基溶化后，冷至45℃左右時(shí)倒平板，凝固后待用。第31頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三32紫外線誘變紫外線處理（a）將紫外線燈開關(guān)打開預(yù)熱約20分鐘。（b）取直徑6cm無菌平皿2套，分別加入上述菌懸液5ml，并放入無菌攪拌棒于平皿中。（c）將盛有菌懸液的2平皿置于磁力攪拌器上，在距離為30cm，功率為15W的紫外線燈下分別攪拌照射1分鐘及3分鐘。稀釋在紅燈下，將上述經(jīng)誘變處理的菌懸液以10倍稀釋法稀釋成10-1-10-6（具體可按估計(jì)的存活率進(jìn)行稀釋）。涂平板取10-4、10-5、10-6三個(gè)稀釋度涂平板，每個(gè)稀釋度涂平板3只，每只平板加稀釋菌液0.1ml，用無菌玻璃刮棒涂勻。以同樣操作，取未經(jīng)紫外線處理的菌稀釋液涂平板作對(duì)照。

第32頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三33培養(yǎng)：將上述涂勻的平板，用黑布（或黑紙）包好，置37℃培養(yǎng)48小時(shí)。注意每個(gè)平皿背面要標(biāo)明處理時(shí)間和稀釋度。計(jì)數(shù)：將培養(yǎng)48小時(shí)后的平板取出進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，根據(jù)對(duì)照平板上菌落數(shù)，計(jì)算出每毫升菌液中的活菌數(shù)。同樣計(jì)算出紫外線處理1分鐘、3分鐘后的存活細(xì)胞數(shù)及其致死率。

觀察誘變效應(yīng)：

將細(xì)胞計(jì)數(shù)后的平板，分別向菌落數(shù)在5-6個(gè)左右的平板內(nèi)加碘液數(shù)滴，在菌落周圍將出現(xiàn)透明圈。分別測量透明圈直徑與菌落直徑并計(jì)算其比值（HC值）。與對(duì)照平板進(jìn)行比較，根據(jù)結(jié)果，說明誘變效應(yīng)。并選取HC比值大的菌落移接到試管斜面上培養(yǎng)。此斜面可作復(fù)篩用。第33頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三34B快中子中子產(chǎn)生：中子可由回旋加速器、靜電加速器或原子反應(yīng)堆產(chǎn)生。中子不直接產(chǎn)生電離，但能使吸收中子的物質(zhì)的原子核射出質(zhì)子來，因而快中子的生物學(xué)效應(yīng)，幾乎完全是由質(zhì)子造成的。

快中子：中子分為快中子和慢中子。慢中子的效應(yīng)同α射線、γ射線和電子等照射時(shí)引起的基本相同，快中子較X射線、γ射線具有較大的電離密度，因而能更多地引起點(diǎn)突變和染色體畸變。劑量：用快中子進(jìn)行誘變育種時(shí)，用菌懸浮液或長在平皿上的菌落進(jìn)行處理，所用劑量范圍約為100—1500戈。第34頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三35C氮芥氮芥是一種極易揮發(fā)的油狀物，一般使用它的鹽酸鹽。應(yīng)用時(shí)先使氮芥鹽酸鹽與碳酸氫鈉起作用，釋放出氮芥子氣，再與細(xì)胞起作用而造成變異。ClCH2CH2ClCH2CH2NH·HCl其鹽酸鹽結(jié)構(gòu)式為：第35頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三36氮芥的誘變機(jī)制、解毒誘變機(jī)制：氮芥能引起染色體畸變，是被利用得最早的一種誘變劑。青霉素產(chǎn)生菌的選育，獲得了良好的效果。

解毒：氮芥鹽酸鹽在碳酸氫鈉溶液中呈游離狀態(tài)，甘氨酸能與氮芥(在碳酸氫鈉參與下)結(jié)合，形成無毒化合物，因此它有解毒作用。其反應(yīng)式為：第36頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三37氮芥使用方法配制活化劑和解毒劑稱取碳酸氫鈉68mg加入蒸餾水10mL，即為活化劑；稱取碳酸氫鈉136mg,甘氨酸120mg,溶解在200mL蒸餾水中，即為解毒劑。將這兩種溶液高壓滅菌備用。將一只小瓶和橡皮塞滅菌、烘干、稱取約10mg的氮芥鹽酸鹽放入瓶中，再加入滅菌蒸餾水2mL，則成為每毫升含有5mg的氮芥鹽酸鹽溶液。第37頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三38氮芥使用方法吸取1mL孢子懸浮液(濃度為200萬孢子／mL)于另一滅過菌的小瓶中，加入0.6mL緩沖液，再加入0.4mL上述氮芥溶液，將橡皮塞蓋緊，搖勻，此時(shí)瓶中的氮芥作用濃度為每毫升1mg。加入氮芥溶液30秒鐘后開始計(jì)算時(shí)間，達(dá)到所需要的時(shí)間后，用1mL注射器吸取0.1mL處理液加到9.9mL的解毒劑中，使氮芥作用停止。第38頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三39D亞硝酸誘變機(jī)理：亞硝酸是一種常用的有效誘變劑，其誘變作用主要是脫去堿基中的氨基。例如A、C、G分別被脫去氨基而成為次黃嘌呤(H)、尿嘧啶(U)、黃嘌呤(X)等。復(fù)制時(shí)，它們分別與C、A、C配對(duì)。前兩種情況可以引起堿基對(duì)的轉(zhuǎn)換而造成突變。由A：TG：C，G：CA：T的轉(zhuǎn)換已經(jīng)得到證實(shí)。由于X(黃嘌呤)的分子結(jié)構(gòu)只能與C配對(duì)，不能與T配對(duì)；所以它不能引起G：CA：T的轉(zhuǎn)換因而不會(huì)造成突變。亞硝酸還會(huì)引起DNA兩條鏈之間的交聯(lián)而造成DNA結(jié)構(gòu)上的缺失，機(jī)制不清楚。第39頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三40A亞硝酸誘變機(jī)理第40頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三41亞硝酸誘變機(jī)理第41頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三42亞硝酸很不穩(wěn)定，容易分解成水和硝酸酐(2HNO2→N2O3+H2O)：硝酸酐繼續(xù)分解放出NO和NO2(N2O3→NO↑+NO2↑)。可在臨用前將亞硝酸鈉放在pH4.5的醋酸緩沖液中，生成亞硝酸(NaNO2+H+

→HNO2+Na+）亞硝酸使用方法第42頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三43EN—甲基-N'硝基—N—亞硝基胍(NTG)

亞硝基胍是亞硝基烷基類化合物的一種，可誘發(fā)營養(yǎng)缺陷型突變，不經(jīng)淘汰便可直接得到12%-80%的營養(yǎng)缺陷型菌株，有超誘變劑之稱。應(yīng)用原理：酸性條件：在pH低于5-5.5的條件下，形成HNO2而引起菌種突變；堿性條件：以重氮甲烷的形式對(duì)DNA起烷化作用；pH6時(shí)：兩者均不產(chǎn)生，此時(shí)的誘變效應(yīng)可能是由于NTG本身對(duì)核蛋白體引起的變化所致。處理?xiàng)l件：NTG在甲酰胺中溶解度較大，用甲酰胺溶解NTG可以提高處理濃度。通常在濃度為300μg/mL，溫度為28℃和時(shí)間60分鐘的條件下處理，容易獲得高產(chǎn)菌株。第43頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三442.2.3抗噬菌體菌株的選育第44頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三451噬菌體的分布噬菌體廣泛分布在自然界，存在于土壤、肥料、糞便和污水中。在工廠生產(chǎn)中，對(duì)排出的菌體如不及時(shí)處理，便有可能在下水道的污水和四周土壤中滋生噬菌體，在情況嚴(yán)重時(shí)，甚至從空氣中亦能分離到噬菌體?！疶4Bacteriophage

(TEMx390,000)

第45頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三46一種噬菌體感染大腸桿菌第46頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三47噬菌體的意義細(xì)菌基因轉(zhuǎn)導(dǎo)醫(yī)藥用途（1）鑒別細(xì)菌；（2）治療的佐劑：如痢疾的預(yù)防與治療，配合抗生素。噬菌體的危害：微生物發(fā)酵工業(yè)深受噬菌體危害。例如抗生素工業(yè)、微生物農(nóng)藥和有機(jī)溶劑發(fā)酵等工業(yè)中，普遍存在著噬菌體的危害。當(dāng)發(fā)酵過程污染了噬菌體后，輕者使發(fā)酵周期延長，發(fā)酵單位(產(chǎn)量)降低，重則造成倒罐，釀成經(jīng)濟(jì)損失，已成為發(fā)酵工業(yè)的大敵。噬菌體的經(jīng)濟(jì)意義第47頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三482抗噬菌體菌株的選育在工業(yè)微生物發(fā)酵過程中，有不少品種遭受噬菌體的感染，使生產(chǎn)不能進(jìn)行。這種瓦解細(xì)胞的噬菌體稱為烈性噬菌體。在出現(xiàn)噬菌體以后必須選育抗噬菌體菌株和配合其他措施使生產(chǎn)繼續(xù)進(jìn)行。由于噬菌體很易發(fā)生變異，因此又會(huì)出現(xiàn)新的噬菌體，對(duì)噬菌體原具有抗性的菌株又會(huì)出現(xiàn)不抗。所以既要不斷收集噬菌體，又要不斷選育新的抗性菌株，以確保生產(chǎn)正常進(jìn)行。第48頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三49A抗噬菌體菌株選育的幾種方法自然突變以噬菌體為篩子，敏感菌株的孢子不經(jīng)任何誘變由其自然突變?yōu)榭剐跃?，抗性突變頻率很低。誘發(fā)突變

敏感菌株先經(jīng)誘變因素處理，然后將處理過的孢子液分離在含有高濃度的噬菌體的平板培養(yǎng)基上，經(jīng)誘變后的存活孢子中，如存在抗性變異菌株就能在此平板上生長。誘變可以提高抗性菌株的頻率?；?qū)⒚舾芯咦咏?jīng)誘變后接入種子培養(yǎng)基，待菌絲長濃后加入高濃度的噬菌體再繼續(xù)培養(yǎng)幾天，再加入噬菌體反復(fù)感染，使敏感菌被噬菌體所裂解，最后取再生菌絲進(jìn)行平板分離，從中篩選抗性菌株。第49頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三50B抗噬菌體菌株的特性試驗(yàn)無論從自然突變或誘發(fā)突變所得到的抗噬菌體菌株，在用于生產(chǎn)之前，均需經(jīng)過反復(fù)驗(yàn)證，才能使用?？故删w性狀的穩(wěn)定性試驗(yàn)抗性菌株分別在孢子培養(yǎng)、種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)過程中用點(diǎn)滴法或雙層瓊脂法測定噬菌斑。不出現(xiàn)噬菌斑，說明該菌株對(duì)此噬菌體具有抗性。觀察抗性菌株多次傳代后對(duì)噬菌體的抗性是否穩(wěn)定。第