DB6501T 044-2023 動物源肺炎克雷伯菌檢驗

ICS11.220CCSICS11.220CCSB41烏 魯 木 齊 市 地 方 標 準DB6501/T044—2023動物源肺炎克雷伯菌檢驗發(fā)布烏魯木齊市市場監(jiān)督管理局發(fā)布烏魯木齊市市場監(jiān)督管理局202306-0120230525DB6501/T044—2023DB6501/T044—2023DB6501/T044—2023DB6501/T044—2023目 次前言 III1范引文件 1語定義 1備材料 1養(yǎng)和劑 2要求 2培基 2試劑 2準株 2物全求 3品集保運輸 3鼻子直腸/腔拭子 3生乳品 3組樣品 3驗序 34離化 4蘭染鏡檢 44生鑒定 4質鑒定 5PCR鑒定 5果報告 6株藏 6附錄A（范） 培基和劑 7營肉（NB） 7麥凱醇東芐青素脂（MIAC） 7營瓊（NA） 7羧青素 8氧酶驗劑 8無菌0.85%理水 85%糖脂保劑 8III附錄B（料） 肺克雷菌Khe因PCR增目片測序列 10II前 言本文按GB/T1.1—2020《準工導則 第部分標化件結和起規(guī)》起草。本文件由烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心提出。本文件由烏魯木齊市農業(yè)農村局（烏魯木齊市鄉(xiāng)村振興局）歸口并組織實施。（本文件實施應用中的疑問，請咨詢?yōu)豸斈君R市動物疾病控制與診斷中心。III號）。III號）468588303DB6501/T044—2023DB6501/T044—2023DB6501/T044—2023DB6501/T044—2023動物源肺炎克雷伯菌檢驗范圍（Klebsiella本文件適用于動物鼻拭子、直腸/泄殖腔拭子、生鮮乳、組織等樣品中肺炎克雷伯菌的檢驗。（1冰箱：2℃～8℃，-20℃或以下；恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃；電子天平：感量10mg；全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)；基質輔助激光解吸飛行時間質譜儀（MALDI-TOF-MS）；PCR儀；1冰箱：2℃～8℃，-20℃或以下；恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃；電子天平：感量10mg；全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)；基質輔助激光解吸飛行時間質譜儀（MALDI-TOF-MS）；PCR儀；二級生物安全柜；顯微鏡；核酸電泳儀:配水平電泳槽；電泳凝膠成像分析系統(tǒng)；4 肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumoniae肺炎克雷伯菌屬腸桿菌科克雷伯氏菌屬，為革蘭氏染色陰性的粗短桿菌，大小0.5μm～0.8μm×1μm～2μm,下列術語和定義適用于本文件。3 高壓滅菌器；電熱爐；pH計或精密pH試紙。微量移液器5 要求GB/T6682A2肺炎克雷伯菌ATCC700603。6 氧化酶試劑：見附錄A.6；0.85%生理鹽水：見附錄A.7；5%蔗糖脫脂乳保護劑：見附錄A.8；2肺炎克雷伯菌ATCC700603。6 氧化酶試劑：見附錄A.6；0.85%生理鹽水：見附錄A.7；5%蔗糖脫脂乳保護劑：見附錄A.8；聚合酶鏈式反應預混液（2×PCRMasterMix）；TAE緩沖液；瓊脂糖；甘油；碘伏。羧芐青霉素：見附錄A.5，商品化羧芐青霉素溶液則按說明書配制；革蘭氏染色液：商品化革蘭氏染色液套裝；生化鑒定卡（全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)用）或商品化生化鑒定試劑；基質液（飛行時間質譜儀用）：取α-氰-4-羥基肉桂酸(HCCA)，按說明書配制溶液；或用市售5.3.15.3.25.3.35.3.4商品；5.3.55.3.65.3.75.3.85.3.95.3.105.3.115.3.12（NB）A.1（MIAC）A.2營養(yǎng)瓊脂：見附錄A.3A.4試劑PCR鑒PCR鑒實驗室設施設備、人員防護、實驗安全操作、實驗廢棄物及菌株處理應符合GB19489的要求。鼻拭子、直腸/泄殖腔拭子5mL～10mL0℃～424。生鮮乳樣品先用消碘伏擦拭消毒動物乳頭及周邊，棄前3把乳汁，擠取10mL～20mL乳汁于無菌容器。0℃～4℃保存、運輸，不宜超過24h。若超過24h，-20℃冷凍保存、運輸。3生化定 質譜定營養(yǎng)肉湯36℃±1℃，18h～24h麥康凱肌醇阿東醇羧芐青霉素瓊脂可疑落 36℃±1℃，18h～24營養(yǎng)3生化定 質譜定營養(yǎng)肉湯36℃±1℃，18h～24h麥康凱肌醇阿東醇羧芐青霉素瓊脂可疑落 36℃±1℃，18h～24營養(yǎng)36℃±1℃，18h～24h革蘭氏染色鏡檢樣品肺炎克雷伯菌檢驗程序見圖1。9 組織樣品0℃～4h24h，-20肺炎克雷伯菌肺炎克雷伯菌圖1 肺炎雷菌驗增菌36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h1mL～2mL5mL～10mL36℃±1℃培養(yǎng)18h；1g～25mL～10mL36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，36118h～24h。413 鑒定生化鑒定、質譜鑒定、PCR鑒定3種方法任選其一。生化鑒定413 鑒定生化鑒定、質譜鑒定、PCR鑒定3種方法任選其一。生化鑒定挑取純培養(yǎng)的菌落進行肺炎克雷伯菌生化鑒定，全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)或手工操作生化鑒定試劑（表1）均按其說明書進行操作和結果判定。表1 肺炎雷菌化性挑取營養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)的純化菌落進行革蘭氏染色鏡檢。肺炎克雷伯菌為革蘭氏染色陰性短桿菌，單個、成雙或成短鏈排列，有莢膜。符合鏡檢特征的可疑菌落進行下一步鑒定。試驗項目肺炎克雷伯菌肺炎亞種肺炎克雷伯菌臭鼻亞種動力試驗---氧化酶試驗---尿素酶+d-MR-++VP+--西蒙氏枸橡酸鹽+d-試驗項目肺炎克雷伯菌肺炎亞種肺炎克雷伯菌臭鼻亞種D-酒石酸鹽d--丙二酸鹽+-+ONPG++-賴氨酸脫羧酶+d-分解葡萄糖產氣+d-乳糖+d-衛(wèi)矛醇d--靛基質---注：“+”≥90%陽性，“+/-”75%～88%陽性，“d”為不定，“-/+”75%～89%陰性，“-”≥90%陰性。質譜鑒定13.2.1 溶液滴于樣品上，混勻，室溫干燥。檢測樣品前，應對飛行時間質譜儀進行校準。測定取制備好的樣品靶板，置質譜儀鈀靶板中，編輯樣品信息后，進行譜圖的數(shù)據(jù)采集。溶液滴于樣品上，混勻，室溫干燥。檢測樣品前，應對飛行時間質譜儀進行校準。測定取制備好的樣品靶板，置質譜儀鈀靶板中，編輯樣品信息后，進行譜圖的數(shù)據(jù)采集。B.1。PCR鑒定0.5mL10min,12000r/min2min引物針對肺炎克雷伯菌溶血酵素基因（khe），引物序列為上游5′-TGATTGCATTCGCCACTGG-3′，下游5′-GGTCAACCCAACGATCCTG-3′,擴增長度428bp。擴增5PCR反應體系（25μL）：2×PCRmasterMix12.5μL，上游引物（10μmoL/L）0.5μL，上游引物（10μmoL/L）0.5μL，水10.5μL，模板1μL。PCR反應條件：95℃5min;95℃30s，60℃30s，72℃30s，35個循環(huán);72℃10min，擴增結束后4℃保存。電泳取PCR擴增產物,于2%的瓊脂糖凝膠中電泳,凝膠成像分析。擴增條帶符合428 bp,應將擴增產物測序，并將測定的序列通過NCBI/BLAST 工具菌。根據(jù)檢驗結果報告樣品中檢出或未檢出肺炎克雷伯菌。665%20℃或以下保藏。附錄A（）（NB）成分蛋白胨 10.0g牛肉粉 3.0g氯化鈉 5.0g水 1000mL制法將A.1.1成分溶解于水中，調節(jié)pH值至7.2±0.2（25℃），121℃高壓滅菌15min，備用。（MIAC）成分A.3.2 制法將A.3.1成分加熱溶解于水中，調節(jié)pH值至7.3±0.1（25℃），121℃高壓滅菌15min，備用。710.0gA.3.2 制法將A.3.1成分加熱溶解于水中，調節(jié)pH值至7.3±0.1（25℃），121℃高壓滅菌15min，備用。710.0g3.0g5.0g15.0g1000mL蛋白胨牛肉粉氯化鈉瓊脂水A.2.2 制法將A.2.1pH1550℃左右時，每200mL20mg（NA）成分15.0g0.05g0.001g1000mL瓊脂中性紅結晶紫水肌醇5.0g阿東醇5.0g氯化鈉5.0g豬膽鹽5.0g成分胰蛋胨 10.0g氯化鈉 5.0g瓊脂 5.0g水 1000mL制法將A.4.1加熱溶解于水中，調節(jié)pH至7.4±0.1，分裝試管，121℃高壓滅菌15min，直立凝固，備用。成分羧芐青霉素鈉制法810.0g810.0g脫脂乳A.7.2 制法氯化鈉加入1000mL蒸餾水中，攪拌至完全溶解，分裝，121℃滅菌15min，備用。5成分8.5g1000mL氯化鈉蒸餾水成分四甲基對苯二胺1.0g蒸餾水 100mL制法2℃～8d無菌0.85 理水成分99蔗糖 5g水 100mLA.8.2 制法取A.8.1各成分，混合，112℃高壓滅菌15min，備用。1010附錄B（資料性）肺炎克雷伯菌Khe基因PCR擴增目標片段測序序列GGTCAACCCAACGATCCTGGCGCGTCGCGGCATAGCCGGGATTGAGCGGGTAATAAATGCGGTTGTACTTCTTGTTGGCCTCGCCCACCACCAGCAGACGAACTTCCTGCTCGGTGTTATTGAGAAAGGTGTGGCAGATGCCGGTACCAGCGGGAAAACCCACGCTGTCGC