微生物學重組與質粒

微生物學重組與質粒第1頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月第九講

原微核生物重組和質粒AdvancedMicrobiology主講人：吳瑩瑩wuyingying2頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月綱要細菌的重組：一般原理細菌的質粒（應用：質粒載體）DNA轉化轉導細菌的結合轉座因子第3頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月原核微生物的遺傳物質染色體DNA

環(huán)狀或線狀雙鏈DNA,，不與組蛋白結合；

單倍體；

決定主要性狀。2.染色體外DNA

較小的共價閉合環(huán)狀或線狀雙鏈DNA，如質粒；

一般多拷貝；

決定次要性狀。3.基因一般連續(xù)排列，轉錄和翻譯偶聯(lián)第4頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月1.細菌的重組：一般原理基因重組（generecombination）：將兩個不同性狀個體的基因通過一定的方式轉移到一起，并發(fā)生重新組合，產生新的遺傳性狀的過程，稱為基因重組(generecombination)或遺傳重組。

不同的親本DNA---交換---重組重組：遺傳物質在分子水平上發(fā)生的交換；雜交：在細胞水平上遺傳物質的交換.

雜交必然包含著重組，但重組不僅限于雜交這一形式。第5頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月3.DNA轉化定義：受體細胞直接吸收供體細胞的DNA片段,并與其染色體同源片段進行遺傳物質交換，從而使受體細胞獲得新的遺傳性狀的現(xiàn)象。轉化子（transformant）：經轉化后出現(xiàn)了供體性狀的受體細胞稱為轉化子，即轉化成功的菌落。

目前已知有二十多個種的G+和G-細菌具有自然轉化的能力，此過程可以發(fā)生在土壤和海洋環(huán)境中，可能是自然界遺傳交換的重要方式。第6頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月轉化的過程感受態(tài)階段

受體菌成為感受態(tài)

產生DNA受體位點（DNA結合蛋白）或局部原生質體化

條件：

特殊遺傳類型

誘導因子：多肽類物質、SSCS、CaCl2、低溫等第7頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月什么是感受態(tài)感受態(tài)：是指受體細胞最易接受外源DNA片段并能實現(xiàn)轉化的一種生理狀態(tài)。一個細菌能否出現(xiàn)感受態(tài)是由其遺傳性決定的，但受環(huán)境條件的影響也很大，因而表現(xiàn)差別很大。

感受態(tài)細胞（competentcell）：具有攝取外源DNA能力的細胞。自然感受態(tài)細胞人工感受態(tài)細胞第8頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月自然感受態(tài)與人工感受態(tài)人工感受態(tài)則是通過人為誘導的方法，使細胞具有攝取DNA的能力，或人為地將DNA導入細胞內。該過程與細菌自身的遺傳控制無關自然感受態(tài)的出現(xiàn)是細胞一定生長階段的生理特性（如肺炎鏈球菌的感受態(tài)出現(xiàn)在對數(shù)生長期）受細菌自身的基因控制第9頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月轉化因子

本質是離體的DNA片斷或質粒DNA。在不同的微生物中，轉化因子的形式不同，dsDNA或ssDNA。其中最易與細胞表面結合的仍是dsDNA。

由于每個細胞表面能與轉化因子相結合的位點有限（如肺炎鏈球菌約10個），因此，從外界加入無關的dsDNA就可競爭并干擾轉化作用。

質粒DNA也是良好的轉化因子，但它們通常并不能與核染色體組發(fā)生重組。

轉化的頻率通常為0.1％～1％，最高為20％。第10頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月II.DNA的結合與吸收III.轉化DNA的整合（RecA蛋白介導）第11頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月4.轉導轉導：利用完全或部分缺陷噬菌體為媒介，把供體細胞的小片段DNA攜帶到受體細胞中，通過交換與整合，使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象。

由轉導作用而獲得供體細胞部分遺傳性狀的重組受體細胞稱為轉導子（transductant）。

攜帶供體部分遺傳物質（DNA片段）的噬菌體稱為轉導噬菌體。細菌轉導的二種類型：普遍性轉導局限性轉導第12頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月普遍性轉導（generalizedtransduction）由烈性或溫和噬菌體在裂解寄主菌的過程中進行的任何宿主基因轉導。條件：

存在錯誤包裝的可能

供體寄主菌的DNA在完全降解前即被包裝結果：

攜帶供體菌DNA的噬菌體再侵染受體菌，與受體菌的DNA同源重組，形成穩(wěn)定的轉導子。第13頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月轉導模型第14頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月普遍性轉導的三種后果：進入受體的外源DNA通過與細胞染色體的重組交換而形成穩(wěn)定的轉導子流產轉導（abortivetransduction）轉導DNA不能進行重組和復制，但其攜帶的基因可經過轉錄而得到表達。特點：在選擇培養(yǎng)基平板上形成微小菌落外源DNA被降解，轉導失敗。如果受體菌通過普遍轉導獲得了供體菌DNA片段后，在其體內不發(fā)生基因的交換、整合和復制，只進行轉錄、翻譯和性狀的表達。這種轉導被稱為流產轉導.第15頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月局限性轉導（restrictedtransduction）由溫和噬菌體通過溶原階段連接供體菌基因后再誘導溶菌，并把供體菌特異基因帶給受體菌的轉導過程。在裂解寄主菌的過程中進行的任何宿主基因轉導。條件：

原噬菌體發(fā)生不正常切割結果：

形成缺陷噬菌體（如λdgal），再侵染，整合，形成轉導子。第16頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌中λ噬菌體的正常裂解及半乳糖基因轉導噬菌體的形成過程第17頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月兩種轉導的特性比較普遍轉導局限轉導轉導的發(fā)生自然發(fā)生人工誘導（uv）噬菌體形成誤包前噬菌體的“誤切”內含DNA只含宿主DNA含噬菌體和宿主DNA轉導性狀供體的任何性狀前噬菌體兩端鄰近基因轉導過程雙交換（轉導DNA替換受體DNA同源區(qū)）轉導DNA插入，使受體菌為部分二倍體第18頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月5.細菌的結合通過供體菌和受體菌完整細胞間的直接接觸而傳遞大段DNA的過程。由于在細菌和放線菌等原核生物中出現(xiàn)基因重組的機會極為少見，而且較缺少形態(tài)指標，所以關于細菌結合的工作直至Lederberg等1946年采用兩株大腸桿菌的營養(yǎng)缺陷型進行實驗后，才奠定方法學上的基礎。第19頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月中間平板上長出的原養(yǎng)型菌落是兩菌株之間發(fā)生了遺傳交換和重組所致！

1946年，JoshuaLederberg和EdwardL.Taturm的多重營養(yǎng)缺陷型雜交實驗。為了減少所培養(yǎng)的結果是回復突變的機會，采用了雙重或三重營養(yǎng)缺陷型。該實驗是建立在不大可能同時發(fā)生兩種或三種回復突變的設想上的。結合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)第20頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月結合現(xiàn)象的證實證實接合過程需要細胞間的直接接觸的“U”型管實驗（BernardDavis，1950）結合：兩個不同的微生物細胞之間接觸，遺傳物質進行單向轉移、交換，形成一個新個體。第21頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月能進行結合的微生物種類主要在細菌和放線菌中存在。在細菌中，G－細菌尤為普遍，如E.coli、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、弧菌屬、和假單胞菌屬等；放線菌中，以鏈霉菌屬和諾卡氏菌屬最為常見，其中研究得最為詳細的是天藍色鏈霉菌（Streptomycescoeilcolor）。在不同屬的一些菌種之間也可發(fā)生接合現(xiàn)象，如大腸桿菌與鼠傷寒沙門氏菌間或沙門氏菌與痢疾志賀氏菌間。在所有對象中，接合現(xiàn)象研究得最多、了解得最清楚的是E.coli

。E.coli

是有性別分化的，決定性別的是其中的F質粒，F(xiàn)質粒還是合成性菌毛基因的載體。第22頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月結合的過程（滾環(huán)模型）第23頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月F因子的存在方式和相互關系F-F+第24頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月F因子的整合方式第25頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月高頻重組的特點接合中DNA轉移過程有著穩(wěn)定的速度和嚴格的順序性。染色體上越靠近F因子的先導區(qū)的基因，進入的機會就越多，在F-中出現(xiàn)重組子的的時間就越早，頻率也高。第26頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月中斷雜交技術和基因定位利用Hfr×F-的接合過程，在不同時間取樣，并把樣品猛烈攪拌以分散接合中的細菌，然后分析受體細菌基因型，以時間(分鐘)為單位繪制遺傳圖譜，該圖譜是細菌染色體上基因順序的直接反映。第27頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月6.轉座因子

轉座遺傳因子：

位于染色體或質粒上的特殊的可移動的DNA序列。

轉座可引起基因的突變、重組等。

依據(jù)分子結構和特點不同，分為：

插入序列(insertionsequence,IS)

轉座子(transposon,Tn)

轉座噬菌體(mutatorphage)第28頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月插入序列(IS)一類除了和它的轉座作用有關的基因外不帶有任何其它基因的轉座因子。它們是較小的轉座因子，可以在染色體、質粒上發(fā)現(xiàn)。F因子和大腸桿菌的染色體上有一些相同的插入序列如IS1、IS2等，通過這些序列間的重組，F(xiàn)因子可插入大腸桿菌的染色體，而使它們成為Hfr菌株。第29頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月轉座子(Tn)

Tn中除了含有轉座所必須的基因外，還含有與轉座無關的一些基因，如抗藥基因以及其它基因如乳糖發(fā)酵基因、熱穩(wěn)定腸毒素基因等。因此，Tn的轉座能使宿主菌獲得有關基因的特性，可作為遺傳標志而易被鑒定出來。不同的符合轉座子的抗性標記不同。Tn5轉座子部分示意圖第30頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月Mu噬菌體

Mu噬菌體是大腸桿菌一種溫和噬菌體。通常每種溫和噬菌體應整合到宿主染色體的一定位置上，可是Mu幾乎可插入宿主染色體的任何一個位置上，而且游離Mu和已插入的Mu基因次序是相同的。另外，它的兩端都沒有粘性末端，插入某種基因中就引起改基因的突變。這些都說明它的整合方式不同于λ噬菌體，而類似于轉座因子的作用。第31頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月轉座的遺傳學效應1.插入突變失活；2.