無菌檢查與微生物限度檢查

無菌檢查與微生物限度檢查1第1頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月

自2002年微生物專業(yè)委員會成立至今，我國藥品微生物檢驗有了革命性的進步，2005版藥典明確了對檢測環(huán)境的要求、對標準的制訂原則做了科學的修訂及引入驗證理念等；2010版藥典增加對培養(yǎng)基適用性檢查、新增了藥品微生物實驗室規(guī)范指導原則等4個附錄。從人員、培養(yǎng)基、菌種、實驗室的布局和運行、設備、文件、實驗記錄、結果的判斷等方面提出了明確的要求。山東省藥品檢驗所2第2頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月微生物實驗室建設問題無菌檢查常見問題微生物限度檢查常見問題抑菌效力檢查法山東省藥品檢驗所3第3頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月

微生物實驗室建設問題基本原則防止微生物污染事件的發(fā)生（包括對環(huán)境、實驗人員、試驗樣品等的）。有利于試驗操作的進行山東省藥品檢驗所4第4頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月USP對于實驗室布局和運作的規(guī)定LayoutofthelabshouldenhanceoperationsPreventcorss-contaminationSeparationofactivitiesPromoteSaftyLabareashouldhaveseparate“clean”and“l(fā)iveculture”areaspoints,barriersWhenasamplehasgrowth,allfurtherworkinthe“l(fā)iveculture”areaSamplingshouldtakeplacecarefullyasepticconditionsEMequipmentshouldbeloadedenviromenttobesampled,andcarefullyhandledIsolatortechnologymaybeuseful山東省藥品檢驗所5第5頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月微生物實驗室可單獨建設也可共用普通建筑，但應自成一區(qū)，單獨設立一層，或一層樓的一端。與建筑物其它區(qū)域相通的部分應有門相隔?？砂此膮^(qū)域劃分：核心實驗區(qū)、緩沖輔助區(qū)、PII級生物安全區(qū)、一般實驗及準備區(qū)。核心實驗區(qū)可按具體工作需要劃分為數(shù)個試驗單元，核心區(qū)各實驗單元最好獨立運行，核心區(qū)與PII級生物安全區(qū)不得共用一套換風系統(tǒng)，嚴格控制交叉污染的發(fā)生。各房間應功能明確，不得混用。藥品檢驗、食品檢驗、化妝品檢驗等不得共用無菌室和緩沖間，防止交叉污染。準備室、潔凈室、培養(yǎng)室等布局，應方便物品的傳送，設置可以互鎖的潔凈雙扉傳遞窗，堅決避免直接的空氣交換防止交叉污染。

微生物實驗室房門應盡量實現(xiàn)自動關閉，緩沖區(qū)門為互鎖。同一區(qū)域內各實驗單元房門應朝向同一方向或交錯布局，防止直接的空氣交換。山東省藥品檢驗所6第6頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月除地面、墻面、頂棚和工作臺外，傳遞窗、物品臺、坐凳、門把手等細微環(huán)節(jié)，也應做到易于清潔，耐腐蝕、不起塵、不開裂、光滑防水，便于消毒。潔凈室內照明、紫外、超凈工作臺等儀器設備開關易設置在第1緩沖間以外，便于控制。潔凈室內各區(qū)域的風速、壓差、溫度、濕度顯示等易設置在第1緩沖間以外或第1緩沖間外可以觀察到的地方，便于觀察紀錄，實時提示屏障系統(tǒng)的有效性。潔凈區(qū)內部和外部宜設置對講設備，便于實驗人員的信息交流和協(xié)作。潔凈室內不應安裝水槽、水管、上下水道等，避免滋生微生物。微生物實驗室空調系統(tǒng)的設計應充分考慮生物安全柜、恒溫水浴、培養(yǎng)箱、冰箱、高壓蒸汽滅菌器等冷、熱、濕和污染負荷。無菌室內不宜放置水浴等對濕度影響較大的儀器，如需要放置應加蓋，并經常換水，防止微生物滋生由于實驗室建成后，結構布局很難變更，所以應對未來的人員編制、檢驗內容、工作量、所需儀器做出規(guī)劃，充分考慮實驗室的承載能力，必要時預留部分空間。山東省藥品檢驗所7第7頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月

山東省藥檢所微生物實驗室平面圖山東省藥品檢驗所8第8頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月

微生物實驗室的環(huán)境監(jiān)控保證微生物實驗室安全、有效運行對實驗結果的可靠性做出有力支持

微生物實驗室建成后，必須配備相應的環(huán)境監(jiān)控設備：浮游菌采集器、塵埃粒子計數(shù)器、風速儀、壓差計、照度計和噪聲計等等，對于微生物實驗室環(huán)境保持，以定期監(jiān)控為主要手段。過多的消毒、熏蒸會對無菌室的通風系統(tǒng)管路和試驗儀器造成一定的腐蝕，影響使用壽命，不合理的擦拭反而可能會增加無菌室污染的機會，同一種消毒劑的反復使用可能會使微生物對消毒劑的耐受力增強。因此，應根據(jù)監(jiān)測情況制定相應的清潔計劃。山東省藥品檢驗所9第9頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月

微生物實驗室的環(huán)境監(jiān)控

——環(huán)境菌庫的建立

方法定期采集潔凈室沉降菌及浮游菌，采用適宜的方法對搜集到的菌株進行鑒定，包括形態(tài)觀察、生化鑒定、遺傳信息分析（16sRNA測序、DNA脈沖場電泳分析等）、傅里葉紅外光譜分析等，對每一株菌建立詳細檔案。目的

1.分析無菌室環(huán)境菌種類、數(shù)量、分布隨時間的變化關系，制定相應的消毒計劃和工作計劃。

2.判斷藥品檢出微生物是否是環(huán)境相關菌，是否與本實驗室環(huán)境菌相關。山東省藥品檢驗所10第10頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月

企業(yè)生產區(qū)域環(huán)境菌庫的建立

當企業(yè)產品的滅菌條件和產品穩(wěn)定性之間產生矛盾時，該如何處理？山東省藥品檢驗所11第11頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月解決方案：建立生產過程中關鍵區(qū)域的微生物監(jiān)控體系，通過長期監(jiān)控，找出關鍵區(qū)域常見抗性菌株，并據(jù)此建立新的滅菌條件。否則，如果環(huán)境中監(jiān)測到更強的耐熱菌株，則應立刻停止生產，進行徹底消毒。此外建立環(huán)境微生物庫和實時監(jiān)控體系，根據(jù)環(huán)境微生物的變化規(guī)律制定相應防范措施和消毒計劃，并可對陽性產品污染環(huán)節(jié)進行排查堵漏。山東省藥品檢驗所12第12頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月

FTIR法用于藥品檢出菌與環(huán)境菌關聯(lián)性分析

定期（月）環(huán)境菌采集FTIR圖譜測定圖譜累積匯總總體環(huán)境菌譜庫當月環(huán)境菌譜庫藥品微生物檢查FTIR圖譜測定D≤0.04D＞0.04非環(huán)境菌疑為內源性環(huán)境菌外源性環(huán)境菌D≤0.04D＞0.04環(huán)境菌山東省藥品檢驗所13第13頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月將27株藥物分離菌平均光譜分別代入譜庫分析，11株Hit值＜0.04，占40.7%，懷疑與環(huán)境菌相關。其中7株分離自六味地黃丸，檢出時間：06年9月。帶入當月譜庫分析：5株Hit值＜0.04，而當月正處于無菌室改造未完成時，所以存在本實驗環(huán)境污染的可能性。其中四株檢出于06年12月，代入當月譜庫分析：4株Hit值均＞0.04，說明這四株菌可能為外源性環(huán)境相關菌。山東省藥品檢驗所14第14頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月2010年版藥典無菌檢查法的結果判斷解讀（1）無菌檢查試驗所用的設備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結果不符合無菌檢查法的要求。（2）回顧無菌試驗過程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素。（3）供試品管中生長的微生物經鑒定后，確證是因無菌試驗中所使用的物品和（或）無菌操作技術不當引起的。山東省藥品檢驗所15第15頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月

微生物鑒定分析工具書

《伯杰細菌手冊》、《真菌鑒定手冊》形態(tài)學生物顯微鏡（最好帶成像系統(tǒng)）生化鑒定手工生化鑒定試劑盒（例如：apiwebTM鑒定軟件價格便宜，國際金標準，應作為常規(guī)配備）全自動生化分析儀（例如VITKE2，價格較貴，可實現(xiàn)大批量檢驗）分子生物學例如16sRNA測序、熒光定量PCR等，價格較貴，高速、敏感和特異性，用于微生物追蹤溯源）傅立葉變換紅外光譜法

Tensor27-HTSXT型微生物鑒定紅外光譜儀，快速，用于環(huán)境菌監(jiān)控及微生物鑒定初篩）

山東省藥品檢驗所16第16頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月

藥品微生物鑒定一般程序

未知微生物（來源于供試品、實驗室環(huán)境、檢驗過程等等）

↓選擇適宜的培養(yǎng)方式進行純化培養(yǎng)（培養(yǎng)基的選擇，需、厭氧條件，培↓養(yǎng)溫度，是否選擇振蕩培養(yǎng)等等）觀察、描述菌落形態(tài)↓革蘭染色及氧化酶試驗、過氧化氫酶試驗等（根據(jù)染色結果、細菌形態(tài)、初步的↓↓生化試驗信息和鑒定目的等等選擇適宜的鑒定方法）↓↓↓生化鑒定分子生物學FTIR（或幾種方法聯(lián)合使用）

↓結果分析（綜合整個實驗過程的所有信息，分析鑒定結果）↓結論

山東省藥品檢驗所17第17頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月

微生物鑒定分析的意義檢驗過程中，不能對所檢出的微生物進行鑒定分析或做出一定的說明，就不能算是一次完整的微生物檢查試驗。無菌檢查法中，增加檢出菌檢定規(guī)定是藥典發(fā)展的必然趨勢?？刂凭袛啵河伞皯M行分離、純化、染色鏡檢和適宜的生化試驗”改為“應進行分離、純化、染色鏡檢和適宜的鑒定試驗”

注重微生物鑒定能力的提高非常重要！山東省藥品檢驗所18第18頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月

無菌檢查前言說明防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出日常檢驗還需要對環(huán)境進行監(jiān)控無菌檢查人員必須具備微生物專業(yè)知識，并經過無菌技術的培訓。

新增的三點說明，使得本版藥典對藥品檢測機構微生物檢驗的綜合能力及軟、硬件配制上，都有了更高的要求。山東省藥品檢驗所19第19頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月

對照品培養(yǎng)基經適用性檢查合格的培養(yǎng)基是否可以作為對照培養(yǎng)基使用？山東省藥品檢驗所20第20頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月

對照培養(yǎng)基系指按培養(yǎng)基處方特別制備、質量優(yōu)良的培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)基適用性檢查。由中國藥品生物制品檢定所研制及分發(fā)。山東省藥品檢驗所21第21頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月

稀釋液、沖洗液的問題如何選擇稀釋液和沖洗液？薄膜過濾法中規(guī)定總的沖洗量不得超過1000ml，而對稀釋液沒有作出具體規(guī)定，稀釋液的用量多少為易？山東省藥品檢驗所22第22頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月

培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁的判斷問題新版藥典規(guī)定：“取該培養(yǎng)液適量轉種至同種新鮮培養(yǎng)基中，細菌培養(yǎng)2天、真菌培養(yǎng)3天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌?！睘楹尾辉龠M行直接劃線培養(yǎng)？如果使用液體培養(yǎng)物進行革蘭染色，培養(yǎng)基成分是否會對鏡檢觀察造成影響？如何解決？山東省藥品檢驗所23第23頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月

驗證用菌種的問題驗證試驗用菌種及菌液制備在培養(yǎng)基靈敏度所用菌種的基礎上，刪除了銅綠假單胞菌，增訂了大腸埃希菌。

在驗證試驗的實踐中，發(fā)現(xiàn)作為革蘭氏陰性桿菌代表的銅綠假單胞菌在驗證試驗中對大部分抗生素不敏感，而大腸埃希菌對抗革蘭氏陰性桿菌為主的抗生素敏感性較好。山東省藥品檢驗所24第24頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月

黑曲霉菌的相關試驗污染及防護問題2005版中國藥典開始使用黑曲霉菌作為試驗用菌種，但試驗過程中，針對該菌種的安全防護問題仍未得到明確而有效的解決方案，因此，時至今日許多藥品檢驗機構和制藥企業(yè)仍未開展相關實驗。山東省藥品檢驗所25第25頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月

黑曲霉菌特性生長速度快，胞子易通過空氣擴散。在普通環(huán)境中生命力較強，傳統(tǒng)的紫外線、循環(huán)風凈化和中低效消毒劑對其作用效果較差，需高效消毒劑方可將其殺滅，例如：苯酚酸類、苯酚堿類等等不耐熱，70℃左右即可被殺滅。能分泌有機酸和毒素，但關于黑曲霉對人體治病的案例并不多見。山東省藥品檢驗所26第26頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月

當前實驗室進行黑曲霉試驗的通常做法：采用傳統(tǒng)的超凈工作臺，關閉風機，靠近火焰。采用生物安全柜采用負壓隔離器山東省藥品檢驗所27第27頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月第一種由于凈化臺本身屬非密閉性操作臺，與外界環(huán)境的氣流交換無法避免，因此，無論是對實驗人員、供試品或實驗環(huán)境都存在嚴重污染隱患；第二種方法較第一種方法在一定程度上可以保證供試品和實驗人員免受污染，但實驗后工作臺面的消毒問題，特別是富集于生物安全柜HEPA上的黑曲霉胞子較難殺滅、清除，成為潛在污染源。第三種方法，全封閉的負壓隔離系統(tǒng)有效防止了微生物污染問題，且有利于高效消毒劑發(fā)揮作用。山東省藥品檢驗所28第28頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月

實驗室根據(jù)黑曲霉菌特性和自身實際，制定一套合理的解決方案。山東省藥品檢驗所29第29頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月

微生物限度檢查方法選擇的原則供試液制備方法、抑菌成分的消除方法及細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法應盡量選擇微生物限度檢查法中操作簡便、快速的方法，且應避免損傷供試品中污染的微生物。對于抑菌作用較強的供試品，在供試品溶液性狀允許的情況下，應盡量選用薄膜過濾法進行試驗。山東省藥品檢驗所30第30頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月

計數(shù)方法驗證過程中供試品稀釋級選擇問題沒有適宜的方法消除供試品中的抑菌作用而導致微生物回收的失敗，可采用能使微生物生長的更高稀釋級供試液進行方法驗證試驗。低稀釋劑菌落計數(shù)過多，影響方法驗證的結果計算，可采用適于方法驗證的稀釋級供試液進行方法驗證試驗。此時更高稀釋級供試液的確認要從低往高的稀釋級進行，但最高稀釋級供試液選擇應根據(jù)供試品應符合的微生物限度標準和菌數(shù)報告規(guī)則，如供試品應符合的微生物限度標準是1克細菌數(shù)不得過1000cfu，那么最高稀釋級是1：10-3。山東省藥品檢驗所31第31頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月

計數(shù)方法驗證的相關問題何種情況下，可選擇更高一級的供試品稀釋液進行方法驗證和檢驗？山東省藥品檢驗所32第32頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月供試品采用常規(guī)方法檢驗菌落計數(shù)結果不符合規(guī)定，是否還要進行方法驗證試驗？計數(shù)方法驗證時，如不能尋找到各驗證用菌回收率均能達到要求的有效方法時，該如何進行檢查？山東省藥品檢驗所33第33頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月

控制菌檢查新版藥典增加了“控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查”檢驗項目包括促生長能力、抑制能力及指示能力的檢查刪除“控制菌驗證時的陰性菌對照組”控制菌判斷：由“應進行分離、純化、染色鏡檢和適宜的生化試驗”修訂為“應進行