核算雜交技術(shù)聚合酶鏈反應

核算雜交技術(shù)聚合酶鏈反應第1頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月概述分子生物學的重要方法之一使用特定標記的已知核酸序列與待測核酸進行特異性的雜交結(jié)合，形成雜交體，并利用相應的顯示技術(shù)來檢測目標核酸的存在及其位置的分子生物學方法第2頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月基本原理第3頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸由許多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，為生命的最基本物質(zhì)之一。核酸廣泛存在于所有動物、植物細胞、微生物內(nèi)、生物體內(nèi)核酸常與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核蛋白。不同的核酸，其化學組成、核苷酸排列順序等不同。根據(jù)化學組成不同，核酸可分為核糖核酸，簡稱RNA；和脫氧核糖核酸，簡稱DNA。DNA是儲存、復制和傳遞遺傳信息的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，RNA在蛋白質(zhì)合成過程中起著重要作用，其中轉(zhuǎn)移核糖核酸，簡稱tRNA，起著攜帶和轉(zhuǎn)移活化氨基酸的作用；信使核糖核酸，簡稱mRNA，是合成蛋白質(zhì)的模板；核糖體的核糖核酸，簡稱rRNA，是細胞合成蛋白質(zhì)的主要場所。第4頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸的結(jié)構(gòu)與特征核酸的結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)：核苷酸以3’，5’磷酸二酯鍵構(gòu)成無分支結(jié)構(gòu)的線性分子二級結(jié)構(gòu)：雙螺旋結(jié)構(gòu)或局部雙鏈三級結(jié)構(gòu)：超螺旋結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)：DNA與蛋白質(zhì)形成復合物第5頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月核算的結(jié)構(gòu)與特征核酸的特性核酸的變性作用爆發(fā)式Tm值核酸的復性作用驟然冷卻緩慢冷卻第6頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸的雜交在適宜的條件下，將不同來源的DNA放在試管里，經(jīng)熱變形后，慢慢冷卻，讓其復性。若這些異源DNA之間在某些區(qū)域有相同的序列，則可以通過互補堿基多之間非共價鍵（氫鍵）的作用，形成穩(wěn)定的雙鏈區(qū)，即復性形成雜交DNA探針（probe）：利用標記分子對其它分子的識別性而實現(xiàn)對后者進行檢測的一種技術(shù)，通常把標記的分子叫探針探針技術(shù)與核酸分子雜交技術(shù)相結(jié)合第7頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月第8頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月核算雜交的方法固相雜交固相支持物應具備的特征：1、具有較強的結(jié)合核酸分子的能力2、與核酸分子結(jié)合后，應不影響其與探針分子的雜交反應3、與核酸分子的結(jié)合穩(wěn)定牢固，能經(jīng)受雜交、洗膜等操作過程而不至于脫落或脫落很少4、非特異性吸附少，在洗膜條件下能將非特異性吸附在其表面的探針分子洗脫掉5、具有良好的機械性能固相雜交類型：Southern印記、Northern印記、組織原位雜交、菌落原位雜交等液相雜交第9頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸探針的制備第10頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月概述核酸探針以研究和診斷為目的，用來檢測特定序列核算的DNA或RNA片段。第11頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸探針的種類DNA探針cDNA探針RNA探針寡核苷酸探針優(yōu)點缺點第12頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸探針的標記和檢測放射性標記

32P和35S切口移位法隨機引物延伸標記法末端標記法125I標記RNA和DNA非放射性標記

生物素、洋地黃毒苷配體-dUTP、辣根過氧化物、堿化基團半抗原、熒光素、化學發(fā)光劑、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶間接標記法直接標記法DNA探針的吖啶酯標記第13頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月Southern印跡雜交第14頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月概述Southernblotting將待測核酸分子通過一定的方法轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定的固相支持物上，即印跡固定于膜上的核酸同標記的探針在一定的溫度和離子強度下退火（復性），即分子雜交過程第15頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月Southernblotting待測核算樣品的制備與限制酶消化采集樣本、提取DNA基因組DNA很長，通常用限制性酶消化第16頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月Southernblotting瓊脂糖凝膠電泳分離待測DNA樣品目的：按片斷長短進行分離，確定雜交靶分子的大小瓊脂糖凝膠濃度的選擇電泳，EB染色，紫外燈觀察凝膠第17頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月Southernblotting電泳凝膠的預處理為了使DNA片段在合理的時間內(nèi)從凝膠中移動出來，必須將最長的DNA片段控制在大約2kb一下0.25mol/LHCl短暫脫嘌呤，堿液浸泡，使DNA變性病斷裂形成較短的單鏈DNA片段，用中性pH的緩沖液中和凝膠中的緩沖液，然后在20×SSC中平衡凝膠10min第18頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月Southernblotting轉(zhuǎn)膜常用固相支持物：NC膜和Nylon膜常用轉(zhuǎn)膜方法：細管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)移法、真空轉(zhuǎn)移法等第19頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月Southernblotting探針標記預雜交與Southern雜交將膜上所能與DNA結(jié)合的位點全部封閉，即預雜交的目的；預雜交后雜交2×SSC淋洗膜后置于合適的容器中并加入10ml左右的預雜交溶液，65℃轉(zhuǎn)動或搖動3-4h；煮沸探針5-10min使其變性，立即加入65℃預熱的雜交液；倒去預雜交液并加完成的雜交液，65℃轉(zhuǎn)動或搖動過夜第20頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月Southernblotting洗膜采用核素標記的探針或發(fā)光劑標記的探針進行雜交的關(guān)鍵一步放射性自顯影檢測X線底片曝光與洗片第21頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月Southernblotting注意事項第22頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月Northern雜交技術(shù)第23頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗原理：

Northern雜交是利用DNA可以與RNA進行分子雜交來檢測特異性RNA的技術(shù)。其基本原理和程序與Southern雜交類似，基本過程包括RNA的提取，瓊脂糖凝膠電泳分離，將變性的RNA從凝膠向濾膜轉(zhuǎn)移，然后與濾膜結(jié)合，最后用標記探針對固定在膜上的RNA進行雜交，用放射自顯影等方法顯示與標記探針序列互補的目的條帶。第24頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月

由于RNA極易降解，而RNA酶不僅無處不在，而且很難消除，所以在操作過程中必須采取必要的措施，包括使用專門準備的用具、試劑和溶液等，所有溶液盡量用DEPC處理后高壓消毒的高質(zhì)量去離子水制備。由于手汗含有大量的RNA酶，因此操作人員必須戴防護手套。第25頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗步驟：

1、進行RNA瓊脂糖凝膠電泳

2、RNA變性

3、將RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上

4、使RNA與尼龍膜結(jié)合

5、RNA與探針雜交

6、洗去非結(jié)合探針

7、放射自顯影顯示與標記探針序列互補的目的條帶第26頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月

變性：由于RNA直接與尼龍膜結(jié)合力差，且具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，必須將RNA先經(jīng)變性劑（甲醛/羥甲基汞/戊二醛）處理，一方面使RNA變性，另一方面可促進RNA與濾膜有效結(jié)合。注意：RNA變性與DNA變性方法不同，不能用堿變性，否則易引起RNA水解。第27頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月

轉(zhuǎn)移：用刀片修飾凝膠，棄去不需要部分和加樣孔以上部分，并在一角切成三角形缺口以做記號。剪取一張略大的尼龍膜，一角剪成與凝膠缺口同樣大小的三角形缺口，將膜漂浮在一盤去離子水表面，待完全侵濕后在10倍SSC中侵泡至少5min。轉(zhuǎn)膜有兩種方法：電轉(zhuǎn)移法和毛細管轉(zhuǎn)移法第28頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月毛細管轉(zhuǎn)移法圖示：第29頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月

電轉(zhuǎn)移法圖示：第30頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月

取出尼龍膜，甩掉多余液體，將有RNA的一面朝上，在濾紙上晾幾分鐘。將尼龍膜晾干后，夾在兩濾紙之間，在真空烘烤箱中80℃烘烤2h。第31頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月雜交將放射性同位素標記的DNA探針經(jīng)100℃煮沸5min和冰浴2min變性，然后將探針和膜放入袋中雜交，在68℃水浴中雜交過夜。

第32頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月

雜交結(jié)束后，將尼龍膜在一定量的0.1%SDS-1倍SSC中室溫下輕輕搖動洗滌10min，然后在一定量的預熱至68℃的0.1%SDS-0.5倍SSC中洗滌3次。

第33頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月

注意事項：

1、EB會影響RNA與尼龍膜的結(jié)合，所以在膠中不能加核酸染料EB。

2、實驗所用的器具、試劑以及實驗環(huán)境一定要防止RNase的污染。

3、所有用于Noethern印跡的溶液均需用DEPC處理后高壓消毒的高質(zhì)量去離子水制備。

4、操作人員必須戴防護手套和口罩，防止RNase污染和操作人員吸入DEPC中毒。第34頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月聚合酶鏈反應第35頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月基因擴增（geneamplification)——

指生物體內(nèi)或體外基因拷貝數(shù)大規(guī)模增加。PCR擴增：應用聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction，PCR）技術(shù)，在體外酶促合成特異DNA片段的一種方法?；驍U增技術(shù)---PCR第36頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA的復制（1）3’-OH進攻5’-PiDNA聚合酶催化DNA的延伸方向:5‘->3’第37頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA的復制（2）DNA復制相關(guān)蛋白在復制起始點打開雙鏈DNA然后DNA解鏈酶結(jié)合到單鏈DNA上進一步解開雙鏈DNA第38頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA的復制（3）第39頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR技術(shù)的創(chuàng)建

KaryB.Mullis（穆利斯（美））Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性,與適當引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設(shè)想。1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術(shù),使Khorana的設(shè)想得到實現(xiàn)。1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù)。1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項重大科學發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學獎。第40頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月故事發(fā)生在1983年

的春夏之交第41頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月KaryB.Mullis(1944-)，在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR。他原本是要合成DNA引物來進行測序工作，卻常為沒有足夠多的模板DNA而煩惱。1983年春夏之交的一個晚上，他開車去鄉(xiāng)下別墅的路上萌發(fā)了用兩個引物（而不是一個引物）去擴增模板DNA的想法…...很少有在公司工作的科研人員得

諾貝爾獎，Mullis是其中之一第42頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月Mullis開車的時候,瞬間感覺兩排路燈就是DNA的兩條鏈，自己的車和對面開來的車象是DNA聚合酶，面對面地合成著DNA……第43頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月Mullis的第一個PCR實驗

1983年9月中旬，

Mullis在反應體系中加入DNA聚合酶后在37℃一直保溫。結(jié)果第二天在瓊脂糖電泳上沒有看到任何條帶。于是他認識到有必要用加熱來解鏈，每次解鏈后再加入DNA聚合酶進行反應，依次循環(huán)。1983年12月，他終于看到了被同位素標記的PCR條帶。第44頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月94℃55℃37℃第45頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月基本原理PCR是一種體外酶促合成特異DNA片段的新方法它由一對引物介導，與模板DNA特異結(jié)合，選擇性地擴增特異的DNA片段反應體系包括：DNA靶序列、引物、四種三磷酸脫氧核苷酸（dNTP）、耐熱DNA聚合酶、合適的緩沖液體系第46頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR技術(shù)的三步反應第47頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR循環(huán)--變性第48頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR循環(huán)--變性第49頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR循環(huán)--變性第50頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR循環(huán)—退火第51頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR循環(huán)—延伸第52頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR循環(huán)—延伸第53頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR循環(huán)—延伸第54頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR循環(huán)—延伸第55頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR整個過程第56頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月第57頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃第58頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點50℃引物1引物2DNA引物第59頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶第60頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點

第1輪結(jié)束第2輪開始95℃第61頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃TaqTaqTaqTaq第62頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點第2輪結(jié)束第63頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點模板DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增第6輪擴增第64頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR的技術(shù)路線第65頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR的基本步驟體系（加樣方法）

10×PCR緩沖液10ulDNA模板0.1-1ugdNTP（2mmol/L）各10ul

兩種引物（10-50umol/L）各1-2ulddH2O（滅菌）加至100ul

離心15s，加石蠟第66頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR的基本步驟PCR循環(huán)預變性97℃，2-5min，迅速冷卻至室溫加入TaqDNA聚合酶主循環(huán)變性94℃30-60s

退火55℃30-60s

延伸72℃60-150s

循環(huán)25-35次終延伸72℃5-10min第67頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月第68頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR的反應體系及其優(yōu)化第69頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月概述模板引物緩沖體系一價或二價陽離子四種dNTP耐熱DNA聚合酶第70頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月模板模板的純化模板DNA片段大小適宜的模板量第71頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月引物

引物：決定PCR反應的特異性

PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增第72頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月

基本原則是最大限度地提高擴增效率和特異性，同時盡可能抑制非特異性擴增。引物設(shè)計的原則第73頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月引物引物的長度引物的擴增跨度引物的組成引物3‘端配對引物的濃度第74頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月①引物長度：15-30bp，常用20bp左右—引物的有效長度不能大于38bp，否則最適延伸溫度會超過TaqDNA聚合酶的最適溫度（74℃），不能保證PCR擴增產(chǎn)物的特異性②引物擴增跨度：以500bp為宜—特定條件下可擴增長至10kb的片段第75頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜

—G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶

—ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，尤其3′端不應超過3個連續(xù)的G或C，因為這樣會使引物在G+C富集區(qū)引發(fā)錯誤延伸④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)和引物間互補

—特別避免3’端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異性的擴增條帶第76頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月第77頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月⑤引物3’端的堿基要求嚴格配對（不能做任何修飾）—特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失?、抟?′端可修飾

—引物5′端限定著PCR產(chǎn)物的長度，但對擴增特異性影響不大；引物5′端堿基可不與模板DNA互補而呈游離狀態(tài)；引物5′端最多可加10個堿基而對PCR反應無影響

第78頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月⑦引物的特異性：—引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性⑧引物量：—每條引物的濃度0.1~0.5μM，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好—引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會第79頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月技術(shù)舉例第80頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月第81頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月第82頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月第83頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月第84頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月第85頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月第86頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月第87頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月第88頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月第89頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月耐熱DNA聚合酶目前有兩種TaqDNA聚合酶供應天然酶：從水生嗜熱桿菌中提純基因工程酶：大腸菌合成一個典型的PCR反應約需酶量1-2.5U/100ul體系濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少第90頁，課件共98頁，創(chuàng)作于2023年2月TaqDNA