現(xiàn)代儀器分析GCLC

現(xiàn)代儀器分析GCLC第1頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月一、色譜分析的概述俄國植物學(xué)家Tswett1901年發(fā)現(xiàn)：利用吸附原理分離植物色素1903年發(fā)表文章：Onanewcategoryofadsorptionphenomenaandtheirapplicationtobiochemicalanalysis1906年Tswett創(chuàng)立“chromatography”—“色譜法”新名詞第2頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月試樣在色譜柱分離示意圖第3頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月1、色譜法的分類1）按物理狀態(tài)分類根據(jù)流動相的物態(tài)：氣相色譜法(GC)和液相色譜法(LC)根據(jù)固定相的物態(tài)：氣-固色譜法、氣-液色譜法、液-固色譜法、液-液色譜法2）按使用的形式分類(1)柱色譜(2)紙色譜(3)薄層色譜3）按分離機理分類(1)吸附色譜(2)分配色譜(3)離子交換色譜(4)凝膠色譜第4頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月2、色譜法的特點1)高選擇性2)高效能3)高靈敏度，適于微量和痕量分析3、色譜法的應(yīng)用1)色譜分析廣泛應(yīng)用于極為復(fù)雜的混合物成分分析2)液相色譜法，在糖類、氨基酸、農(nóng)藥、染料、貴金屬、有機金屬化合物等方面得到了廣泛的應(yīng)用。3)色譜分離是一種非常有效的提純物質(zhì)的技術(shù)，常用于制備分離，得到高純樣品。4)色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀已成為研究分子結(jié)構(gòu)的重要手段。

第5頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月4、幾個色譜常用術(shù)語（以氣相色譜圖為例）1）色譜圖各組分的濃度隨流出時間而分布的曲線稱為色譜曲線，常稱為色譜曲線圖或色譜圖。第6頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月2）色譜峰的高度、寬度、半峰寬度峰高(h)：峰高h指色譜峰最高點到基線的距離，一般用cm為單位。第7頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月峰寬(Y)與半峰寬[Y1/2)從色譜峰兩側(cè)的轉(zhuǎn)折點(拐點)作切線，在基線上的截距叫峰底寬(y)；簡稱峰寬；峰高一半處色譜峰的寬度叫半峰寬(y1/2)。由于色譜峰頂呈圓孤形，色譜峰的半峰寬并不等于峰底寬的一半。第8頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月3)保留時間(tR):是指被測組分從進樣開始到柱后出現(xiàn)濃度最大值時所需的時間。調(diào)整保留時間(tR′)：組分的保留時間與死時間的差值：tR′=tR-t0它表示與固定相發(fā)生作用的組分比載氣在色譜柱中多滯留的時間，實際上是組分在固定相中所滯留的時間。第9頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月二、氣相色譜儀及聯(lián)用技術(shù)AgilentGC6890-5975IMSD第10頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月1、GC的分析過程氣相色譜主要利用物質(zhì)的沸點、極性及吸附性質(zhì)的差異來實現(xiàn)混合物的分離。待分析樣品在汽化室汽化后被惰性氣體帶入色譜柱，柱內(nèi)含有液體或固體固定相，由于樣品中各組分的沸點、極性或吸附性能不同，每種組分都傾向與流動相和固定相之間形成分配或吸附平衡。第11頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月由于載氣的流動，使樣品組分在運動中進行反復(fù)多次的分配或吸附或解析，結(jié)果在載氣中分配濃度大的組分先流出色譜柱，而在固定相中分配濃度大的樣品后流出。當(dāng)組分流出色譜柱后，立即進入檢測器。檢測器能將樣品組分的存在與否變?yōu)殡娦盘枺娦盘柕拇笮∨c被測組分的量或濃度成比例。第12頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月GC的分析流程圖第13頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月樣品色譜圖第14頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月2、氣相色譜儀的構(gòu)成氣路系統(tǒng)進樣系統(tǒng)柱系統(tǒng)檢測系統(tǒng)計算機控制及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)第15頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月2、氣相色譜儀的構(gòu)成氣路系統(tǒng)進樣系統(tǒng)柱系統(tǒng)檢測系統(tǒng)計算機控制及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)第16頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月第17頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月第18頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月第19頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月2.3檢測系統(tǒng)檢測器是色譜儀的“眼睛”氣相色譜檢測器可分為濃度型檢測器與質(zhì)量型檢測器：濃度型檢測器的響應(yīng)值和組分的濃度成正比，質(zhì)量型檢測器的響應(yīng)值和單位時間內(nèi)進入檢測器的質(zhì)量成正比。常用的濃度型檢測器有：熱導(dǎo)池檢測器(TCD)、電子捕獲檢測器(ECD)常用的質(zhì)量型檢測器有：氫火焰電離檢測器(FID)、火焰光度檢測器(FPD)第20頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月熱導(dǎo)池檢測器的結(jié)構(gòu)及測量原理熱導(dǎo)檢測器的依據(jù)是組分和載氣分別具有不同的熱導(dǎo)系數(shù)，它的特點是結(jié)構(gòu)簡單，穩(wěn)定性好，操作容易，靈敏度適中，對無機試樣和有機試樣都能響應(yīng)，是應(yīng)用最廣泛、最成熟的一種通用型檢測器，靈敏度較低。第21頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月氫火焰檢測器的結(jié)構(gòu)原理特點：靈敏度比熱導(dǎo)池檢測器高出三個數(shù)量級，具有結(jié)構(gòu)簡單、靈敏度高、響應(yīng)速度快、應(yīng)用廣泛，適宜于痕量分析。離子化機理：有機物在氫火焰中發(fā)生化學(xué)電離火焰中的正離子以H3O+最多，約占90%；其他還有CHO+，CH3O+，C3H+等。對在氫火焰中不電離的無機化合物，例如CO，CO2，SO2，N2等，不能進行檢測。第22頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月3、分離條件的選擇3.1載氣及流速的選擇熱導(dǎo)池檢測器常用氫氣、氦氣作載氣氫火焰檢測器宜用氮氣作載氣。氫氣：空氣：氮氣的比例為1：10：1，如氫氣30～40ml/min,空氣300～400ml/min,氮氣30～40ml/min。3.2柱溫的選擇柱溫改變時，柱效率、分離度R、選擇性及色譜柱的穩(wěn)定性都將產(chǎn)生相應(yīng)的改變。第23頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月柱溫的影響

色譜柱溫度主要有樣品的復(fù)雜程度和汽化溫度決定。

第24頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月3.3色譜柱固定液的選擇原則：(1)非極性試樣，用非極性固定液；(2)極性試樣，使用極性固定液；(3)極性與非極性的混合物，一般選用極性固定液；(4)能形成氫鍵的試樣，選用極性或形成氫鍵的固定液；(5)復(fù)雜的多組分混合試樣，常用兩種或兩種以上的混合固定液。第25頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月改善柱效率的因素：1）選擇顆粒較小的均勻填料2）選用較低的柱溫操作3）降低擔(dān)體表面液層的厚度4)選用合適的載氣及載氣流速：流速較小時，分子擴散項成為色譜峰擴張的主要因素，宜用相對分子質(zhì)量較大的載氣；流速較大時，傳質(zhì)項為控制因素，宜用相對分子質(zhì)量較小的載氣。第26頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月3.4進樣時間和進樣量的選擇第27頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月4、氣相色譜分析4.1氣相色譜的定性方法依據(jù)：利用色譜圖確定各色譜峰所代表的化合物。常用的方法：純物質(zhì)對照定性、利用保留值定性、利用檢測器的選擇性定性等。第28頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月1）根據(jù)色譜保留值進行定性分析各種物質(zhì)在一定的條件下(固定相、操作條件)，均有確定不變的保留值利用已知成分的純物質(zhì)與未知試樣的色譜峰對照進行定性分析

*利用保留值定性當(dāng)已知某試樣推測為某化合物(例如已用其他方法確定)時，用相應(yīng)化合物的純物質(zhì)進行比較，有相同的峰形和保留值的則為同一種化合物。第29頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月

如果保留時間相同，峰形不同，仍不能認為是同一種物質(zhì)時，將試樣與純物質(zhì)混合后注入色譜柱，若色譜峰增高而半峰寬并不相應(yīng)增加，則兩者可能是同一種物質(zhì)。缺點：重復(fù)性較差利用相對保留值定性優(yōu)點：可以消除某些操作條件的影響，只要柱溫、固定相不變，即使柱徑、柱長、填充情況及流動相的流速有所變化，相對保留值γ仍然不變，它是色譜定性分析的重要參數(shù)。第30頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月2）利用檢測器的選擇性進行定性分析熱導(dǎo)池檢測器(FCD)：對有機化合物和無機化合物均有響應(yīng)，但靈敏度較低；氫焰檢測器(FID)：對有機化合物靈敏度高，對無機氣體、水分等響應(yīng)很?。浑娮硬东@檢測器(ECD)：對鹵素、氧、氯等電負性強的組分有很高的靈敏度，對不含鹵素、氧、氮等電負性強的組分靈敏度很低，甚至不產(chǎn)生響應(yīng)；火焰光度檢測器(FPD)：只對含S，P的物質(zhì)有信號。利用檢測器定性，可以大致判斷被測物的類型。第31頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月4.2定量計算方法歸一化法、外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法等歸一化法歸一化法很直觀，容易接受，計算簡便、準確，當(dāng)操作條件如進樣量、流速等發(fā)生變化時，對計算結(jié)果的影響很小，是一種常用的計算方法。缺點是：必需所有組分都出峰。第32頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月外標(biāo)法利用標(biāo)準品做標(biāo)準曲線，在線型范圍內(nèi)，求得樣品的濃度的一種定量方法。第33頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月內(nèi)標(biāo)法當(dāng)只需測定試樣中某幾個組分，或試樣中所有組分不可能全部出峰時，可采用內(nèi)標(biāo)法。內(nèi)標(biāo)法是將一定質(zhì)量的純物質(zhì)(非被測組分的純物質(zhì))作為內(nèi)標(biāo)物，加入到準確稱取的試樣中，根據(jù)被測物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量及其在色譜圖上相應(yīng)峰面積之比，求出被測組分的質(zhì)量分數(shù)。第34頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月選擇內(nèi)標(biāo)物應(yīng)遵循的原則：試樣中不存在的純物質(zhì)，否則會使色譜峰重疊而無法準確測定試樣的色譜峰面積；內(nèi)標(biāo)物的物理及物理化學(xué)性質(zhì)應(yīng)與被測物相近，當(dāng)操作條件發(fā)生變化時，內(nèi)標(biāo)物與被測物均受到相應(yīng)的影響兩者相對校正因子基本不變；色譜峰位于被測物色譜峰的附近，且能與被測物色譜峰完全分離；內(nèi)標(biāo)物的濃度應(yīng)與被測物的濃度相近。第35頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)點：不要求各組分全部出峰，無歸一化法的限制，即只要被測組分能出峰，不和其他峰重疊，不管其他組分是否出峰或是否重疊，都可以用內(nèi)標(biāo)法進行定量分析，而且定量準確，受操作條件影響較小。缺點：選用合適的內(nèi)標(biāo)物較為困難，每次都要淮確稱量樣品和內(nèi)標(biāo)物的量，不宜作快速分析。第36頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月4.3建立氣相色譜的方法第37頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月4.4應(yīng)用實例第38頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月第39頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月5、聯(lián)用技術(shù)

質(zhì)譜法是一種重要的定性鑒定和結(jié)構(gòu)分析方法，但沒有分離能力，這一點與色譜法剛好互補，后者是一種很好的分離方法，特別適合于復(fù)雜混合物的分離，但對組分的定性鑒別有困難。將兩種方法結(jié)合起來就可以發(fā)揮兩者的優(yōu)點，解決發(fā)展混合物的分離和鑒定。質(zhì)譜可以看成氣相色譜的一個檢測器，通過測定樣品的分子量及結(jié)構(gòu)信息，確定化合物。第40頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月正十二烷EI質(zhì)譜圖第41頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月三、高效液相色譜分析（HPLC）HighPerformanceLiquidChromatography氣相色譜法適用于分析相對分子質(zhì)量較小、沸點較低、熱穩(wěn)定性好的物質(zhì)，這些物質(zhì)約占有機化合物總數(shù)的25%～30%。對于穩(wěn)定性差、相對分子質(zhì)量大(400以上)、沸點高的物質(zhì)，宜用高效液相色譜法進行分析。高效液相色譜法是用液體作為流動相的色譜法。第42頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月基線(baseline)——經(jīng)流動相沖洗，柱與流動相達到平衡后，檢測器測出一段時間的流出曲線。一般應(yīng)平行于時間軸。噪音(noise)——基線信號的波動。通常因電源接觸不良或瞬時過載、檢測器不穩(wěn)定、流動相含有氣泡或色譜柱被污染所致。漂移(drift)——基線隨時間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動相及流量的不穩(wěn)定所引起，柱內(nèi)的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會產(chǎn)生漂移。第43頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月死時間(deadtime，t0)——不保留組分的保留時間。即流動相（溶劑）通過色譜柱的時間。在反相HPLC中可用苯磺酸鈉來測定死時間。死體積(deadvolume，V0)——由進樣器進樣口到檢測器流動池未被固定相所占據(jù)的空間。它包括4部分：進樣器至色譜柱管路體積、柱內(nèi)固定相顆粒間隙（被流動相占據(jù)，Vm）、柱出口管路體積、檢測器流動池體積。其中只有Vm參與色譜平衡過程，其它3部分只起峰擴展作用。為防止峰擴展，這3部分體積應(yīng)盡量減小。V0＝F×t0（F為流速）第44頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月現(xiàn)代高效液相色譜法具有下列特點：1)高壓：液相色譜法使用液體作為流動相(簡稱載液)，液體流過色譜柱時，所遇到的阻力很大，為了使載液迅速通過色譜柱，必須對載液施加高壓。高效液相色譜法工作壓力高達20MPa~30MPa。2)高速：高效液相色譜法的分析時間較經(jīng)典的液相色譜所需的時間要少得多，分離一個樣品只需幾分鐘至幾十分鐘，僅為經(jīng)典液相色譜的幾十分之一。3)高效：一般氣相色譜法的色譜往是數(shù)千塔板／米，高效液相色譜法的塔板數(shù)可達約3萬塔板/米，使分離效率大大提高。第45頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月五個部分：高壓輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、色譜柱、檢測系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。1、高效液相色譜儀第46頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月1.1高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng)由貯液器、高壓泵、梯度洗提裝置組成，核心部分是高壓泵。（一）高效液相色譜的流動相應(yīng)滿足如列要求：

1)應(yīng)具有足夠的純度，一般選用色譜純試劑。

2)流動相與固定液應(yīng)互不相溶。

3)流動相對試樣各組分應(yīng)有適當(dāng)?shù)娜芙舛取?/p>

4)粘度小，檢測器對流動相不產(chǎn)生響應(yīng)。

常用的流動相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。第47頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）梯度洗提裝置應(yīng)用梯度洗提，可以提高分離效果。梯度洗提法：在分離的過程中，應(yīng)用梯度洗提裝置，按一定的程序改變兩種或兩種以上不同極性的溶劑之間的比例，使流動相的成分和極性產(chǎn)生相應(yīng)的變化，從而改變復(fù)雜物質(zhì)中不同極性的組分的相對保留值，提高分離效果，加快分析速度。第48頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）高壓泵高效液相色譜儀的重要組成部分，應(yīng)具備如下性能1）有足夠的輸出壓力，使流動相能順利地通過顆粒很細的色譜柱，通常在14.7MPa～44MPa之間；2）輸出流量恒定無脈動，其流量精度在1%～2%之間；3）輸出流動相的流量范圍廣且流速可調(diào)，對分析儀器，一般為0.2～2mL/min；制備儀器為10～20mL/min。4）壓力平穩(wěn)，脈動小。第49頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月1.2進樣裝置1）閥進樣(六通閥)由閥芯、閥體、定量管組成。優(yōu)點：進樣量的可變范圍大，耐高壓，易于自動化缺點：容易造成色譜峰擴張2)自動進樣,用于大量樣品的常規(guī)分析。第50頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月六通閥使用和維護注意事項：

1)樣品溶液進樣前必須用0.45μm濾膜過濾，以減少微粒對進樣閥的磨損。2)轉(zhuǎn)動閥芯時不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動相受阻，使泵內(nèi)壓力劇增，甚至超過泵的最大壓力；再轉(zhuǎn)到進樣位時，過高的壓力將使柱頭損壞。3)為防止緩沖鹽和樣品殘留在進樣閥中，每次分析結(jié)束后應(yīng)沖洗進樣閥。通?？捎盟疀_洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。第51頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月1.3色譜柱常用內(nèi)壁拋光過的不銹鋼制成標(biāo)準柱型：內(nèi)徑為4.6mm或3.9mm，長為15cm~30cm的直形不銹鋼柱。液相色譜填充柱的填充方法：干法和濕法兩種顆粒直徑大于20μm的可用干法填充顆粒直徑10μm以下的采用濕法裝柱濕法裝柱每米柱效可達3萬塔板第52頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月1.4檢測器靈敏度高、噪音低、線性范圍寬、定量準確、適應(yīng)范圍廣等特點，同時還應(yīng)該對溫度和載液流速的變化不敏感。可用的檢測器有：紫外、折光、電導(dǎo)、熒光、蒸發(fā)光散射等常用的檢測器有：紫外-可見光度檢測器和差示折光檢測器1）紫外-可見光度檢測器一種小型的裝有流動池的雙光束光度計紫外-可見光度檢測器靈敏度很高，檢測限可達10-9g·mL-1優(yōu)點：這種檢測器對溫度和流速不敏感，適宜于梯度洗提缺點：不能用于對紫外-可見光完全不吸收的試樣的檢測第53頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月2）差示折光檢測器一種濃度型檢測器，是通過連續(xù)測定測量池中溶液折射率的變化來測定組分的濃度。優(yōu)點：凡與流動相折射率不同的組分，都可以用差示折光檢測器來檢測，所以差示折光檢測器是一種通用型檢測器。差示折光檢測器的靈敏度較低。缺點：對溫度和流速的波動很敏感。第54頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月1.5數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計算機，峰面積的積分、分析結(jié)果的計算、誤差的分析或色譜圖的輸出記錄的信號進行程序化、自動化處理。液-固色譜法液—液色譜法離子交換色譜法凝膠色譜法2、高效液相色譜法的分類及其分離原理第55頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月3、正相色譜和反相色譜正相分配色譜用極性物質(zhì)作固定相，非極性溶劑(如苯、正己烷等)作流動相反相分配色譜用非極性物質(zhì)作固定相，極性溶劑(如水、甲醇、己腈等)作流動相一般地，正相色譜是固定液的極性大于流動相的極性，而反相色譜是固定相的極性小于流動相的極性。正相色譜適宜于分離極性化合物，反相色譜則適宜于分離非極性或弱極性化合物。第56頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月4、高效液相色譜分離的選擇4.1高效液相色譜法的運