代謝組學：基于質(zhì)譜的研究方法課件

代謝組學：基于質(zhì)譜的研究方法匯報人：張富昌指導教師：田中民西安交通大學2014年4月13日實用文檔內(nèi)容提要一、代謝組學基本知識二、GC-MS和LC-MS三、發(fā)現(xiàn)代謝組學實用文檔一、代謝組學基本知識1、什么是代謝組學代謝組學是通過比較對照組和實驗組的代謝組（metabolomes，某一生物的所有代謝物組分），以尋找其它代謝譜差異的研究方法。這些差異可能與臨床生物標志物發(fā)現(xiàn)中研究的某些疾病相關，也可能與藥物研發(fā)毒理研究中候選藥物攝入后的代謝改變有關。實用文檔一、代謝組學基本知識2、代謝組學的一般流程發(fā)現(xiàn)代謝組學靶向代謝組學代謝組學實用文檔一、代謝組學基本知識3、發(fā)現(xiàn)代謝組學的一般流程鑒定，進行代謝譜分析后，測定這些代謝物的化學結構代謝譜分析（也稱為差異表達分析），在一組實驗和對照樣品中，尋找豐度改變有統(tǒng)計學意義的感興趣代謝物解釋，研究流程的最后一步，解釋所發(fā)現(xiàn)的代謝物與生物過程或生物狀態(tài)之間的關聯(lián)實用文檔一、代謝組學基本知識4、靶向代謝組學的一般流程靶向代謝組學分析的重點是采用大量天然和生物變異樣本，驗證預先確認的代謝物。需要用分析標準品進行定量分析。實用文檔一、代謝組學基本知識5、代謝組學的一般流程實用文檔二、GC-MS和LC-MS1、質(zhì)譜在代謝組學中的應用質(zhì)譜(MS)因具有廣泛的動態(tài)范圍、能進行可重現(xiàn)的定量分析，而且能夠分析非常復雜的生理體液，已被用于代謝組學的研究中。由于這類樣品的復雜性，為了盡可能多地檢測代謝物，在質(zhì)譜分析之前常常還要進行分離（氣相色譜、液相色譜或毛細管電泳）實用文檔2、代謝組學中所用的分離技術氣相色譜(GC)GC要求揮發(fā)性，要用化學衍生化的樣品液相色譜(LC)不能完全解決代謝組中親水組分的分離問題毛細管電泳(CE)所用的緩沖液卻不能與質(zhì)譜儀的離子源兼容

親水相互作用色譜(HILIC)二、GC-MS和LC-MS實用文檔3、代謝組學的挑戰(zhàn)1、典型的代謝組學實驗需大量樣品才能得到精確統(tǒng)計的結果2、代謝組學研究通常需要多種技術；某種類型的樣品往往比其他樣品更適合采用某種特定的分析技術3、需要高度靈敏和精確的儀器4、強大的軟件工具對處理實驗所產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)非常重要

處理GC/MS和LC/MS數(shù)據(jù)的色譜解卷積程序、尋找有意義代謝物的一系列統(tǒng)計分析工具、幫助鑒定代謝物的代謝物數(shù)據(jù)庫，以及最終繪制分子間相互作用網(wǎng)絡圖的生物信息學軟件等。二、GC-MS和LC-MS實用文檔4、GC/MS分析氣相色譜和質(zhì)譜(GC/MS)是分析揮發(fā)性化學物質(zhì)的有效組合。氣相色譜使用運載氣推動分析物通過涂漬的熔融石英毛細管。基于分析物在氣相和毛細管內(nèi)涂層之間的不同分配實現(xiàn)分離。二、GC-MS和LC-MS實用文檔4、GC/MS分析電子轟擊電離(EI)是GC/MS最常用的電離技術，非常耐用而且重現(xiàn)性好，而且不會受離子抑制的影響簡單的鑒定方法只需要扣除了背景的EI圖譜，和一個通用EI譜庫檢索，如NIST譜庫。更有效的鑒定方法是采用包含了預期的化合物保留時間和EI圖譜的特定應用數(shù)據(jù)庫同時對分析物的色譜保留時間和質(zhì)譜圖進行檢索二、GC-MS和LC-MS實用文檔4、GC/MS分析

EI源的缺點

EI電離經(jīng)常會導致分子離子的丟失------找不到匹配的EI譜------缺少的分子離子的質(zhì)量信息將使可能的化合物的數(shù)量變得非常龐大因此，GC/MS最適合對已知的或預期的代謝物進行分析二、GC-MS和LC-MS實用文檔5、LC/MS分析

液相色譜可以分離無揮發(fā)性和未衍生化的代謝物。因此，LC/MS可以分析的化合物種類范圍比GC/MS更廣電噴霧(ESI)和大氣壓化學電離(APCI)是LC/MS最常用的兩種電離技術-----ESI和APCI都可能出現(xiàn)離子抑制，因此共洗脫化合物可能被低估甚至檢測不到

二、GC-MS和LC-MS實用文檔5、LC/MS分析

目前沒有可用于LC/MS鑒定的譜庫。但由于LC/MS分析中通常都有分子離子，其質(zhì)量可以用代謝物數(shù)據(jù)庫進行檢索，如METLIN數(shù)據(jù)庫Q-TOF可以通過分子離子計算出經(jīng)驗式LC/MS最適合作為未知代謝物研究中的探索方法，或者在多種目標代謝物由于揮發(fā)性問題不能用GC/MS進行分析時采用二、GC-MS和LC-MS實用文檔6、LC/MS、GC/MS分析化合物的范圍二、GC-MS和LC-MS實用文檔三、發(fā)現(xiàn)代謝組學1、發(fā)現(xiàn)代謝組學的概念發(fā)現(xiàn)代謝組學主要是將對照組和實驗組的代謝組（某一生物體的全部代謝物）進行比對，以找出其代謝譜的差異。發(fā)現(xiàn)代謝組學分析一般包括以下幾個步驟：?代謝譜分析（也稱為差異表達分析），在一組實驗和對照樣品中，尋找豐度改變有統(tǒng)計學意義的感興趣代謝物?鑒定，進行代謝譜分析后，測定這些代謝物的化學結構?解釋，研究流程的最后一步，解釋所發(fā)現(xiàn)的代謝物與生物過程或生物狀態(tài)之間的關聯(lián)實用文檔三、發(fā)現(xiàn)代謝組學2、代謝譜分析，尋找有統(tǒng)計學意義的代謝物分析重現(xiàn)性對表達譜分析至關重要------分析變異越小，所需的重復數(shù)就越少代謝譜分析是經(jīng)過復雜的特征提取，對已知代謝物進行靶向代謝譜分析，以尋找意外的代謝物------代謝物以其分子特征為標志表示，包括保留時間、質(zhì)量或質(zhì)譜圖及豐度在代謝譜分析過程中，并不一定要知道該化合物/代謝物是什么。但為了在不同次的樣品分析之間跟蹤這些化合物，必需要用到其物理性質(zhì)實用文檔三、發(fā)現(xiàn)代謝組學3、發(fā)現(xiàn)代謝組學有以下六個步驟

1、分析，包括代謝物的分離和檢測，一般采用GC/MS或LC/MS

2、尋找特征，包括尋找樣品中的所有代謝物。一個代謝物檢測不到，就意味著喪失了一次機會；因此盡可能多地檢測出樣品中的代謝物至關重要實用文檔三、發(fā)現(xiàn)代謝組學3、發(fā)現(xiàn)代謝組學有以下六個步驟實用文檔三、發(fā)現(xiàn)代謝組學

3、數(shù)據(jù)標準化，對保留時間和響應的漂移給予必要的校正

4、統(tǒng)計分析，用于發(fā)現(xiàn)樣品組別之間的統(tǒng)計學差異

5、鑒定，GC/MS所得的EI圖譜非常適合進行譜庫檢索

6、解釋，一旦代謝物被鑒定出來，就需要通過解釋實驗結果，推斷其在代謝的生物通路中的地位3、發(fā)現(xiàn)代謝組學有以下六個步驟實用文檔三、發(fā)現(xiàn)代謝組學4、安捷倫GC/MS在發(fā)現(xiàn)代謝組學中的應用在分析方面：?良好的重現(xiàn)性，以便對大量樣品進行比對和校正?卓越的可靠性，最大限度地延長正常運行時間，分析大量樣品?高靈敏度，能夠檢測復雜樣品中的低水平代謝物，動態(tài)范圍超過6個數(shù)量實用文檔三、發(fā)現(xiàn)代謝組學4、安捷倫GC/MS在發(fā)現(xiàn)代謝組學中的應用在尋找特征方面：安捷倫提供自動化質(zhì)譜解卷積和鑒定軟件(AMDIS)進行解卷積，該軟件是NIST譜庫檢索軟件包的一部分。AMDIS軟件包設計用于：?發(fā)現(xiàn)相關的協(xié)變離子，用單組分色譜峰表示?從復雜的GC/MS數(shù)據(jù)中提取出單純組分質(zhì)譜圖?重建用于EI譜庫檢索的質(zhì)譜圖實用文檔三、發(fā)現(xiàn)代謝組學4、安捷倫GC/MS在發(fā)現(xiàn)代謝組學中的應用在數(shù)據(jù)標準化和統(tǒng)計學分析方面：統(tǒng)計學分析軟件需要具備以下功能：?從大樣本組和復雜的實驗設計中，對數(shù)據(jù)（包括元數(shù)據(jù)）進行輕松輸入、標準化和對比?發(fā)現(xiàn)復雜的實驗設計中數(shù)據(jù)間的聯(lián)系—不局限于兩兩對比?鑒定后能夠通過通路分析進行生物學解釋安捷倫的MassProfiler專業(yè)軟件讓您能夠輕松輸入、標準化、比較并圖形化顯示大樣本組的GC/MS和LC/MS數(shù)據(jù)，從而快速發(fā)現(xiàn)代謝物標志物，并支持元數(shù)據(jù)分析。我們用的是SIMCA-P實用文檔三、發(fā)現(xiàn)代謝組學4、安捷倫GC/MS在發(fā)現(xiàn)代謝組學中的應用在數(shù)據(jù)標準化和統(tǒng)計學分析方面：實用文檔三、發(fā)現(xiàn)代謝組學4、安捷倫GC/MS在發(fā)現(xiàn)代謝組學中的應用在解釋方面：

安捷倫MassProfiler專業(yè)軟件的通路分析功能，可以利用已知的或獨特的、用戶基于已有數(shù)據(jù)設定的通路進行解釋，大大簡化了這一過程實用文檔三、發(fā)現(xiàn)代謝組學5、LC/MS在發(fā)現(xiàn)代謝組學中的應用在分析方面：

以下幾點對代謝譜分析非常重要：?良好的LC和MS重現(xiàn)性，以便對大量樣品進行比對和校正?卓越的可靠性，最大限度地延長正常運行時間，分析大量樣品?高靈敏度，能夠檢測復雜樣品中的低水平代謝物，動態(tài)范圍超過5個數(shù)量級實用文檔三、發(fā)現(xiàn)代謝組學5、LC/MS在發(fā)現(xiàn)代謝組學中的應用在尋找特征方面：

安捷倫的MassHunterLC/MS工作站軟件包含獲得專利的分子特征提取算法，專為精確質(zhì)量LC/MS飛行時間數(shù)據(jù)而設計，能夠識別與單一化合物相關的協(xié)變離子。此外，它還能識別和解析常見的電噴霧干擾離子，如鈉加合離子或二聚體的形成。對這些離子鑒別和分組可以改善統(tǒng)計分析所用的定量估算，并從隨后的分析中除去偽數(shù)據(jù)實用文檔三、發(fā)現(xiàn)代謝組學5、LC/MS在發(fā)現(xiàn)代謝組學中的應用在鑒定方面：

METLIN數(shù)據(jù)庫：安捷倫METLIN個人代謝物數(shù)據(jù)庫軟件是目前最全面的代謝物數(shù)據(jù)庫可以根據(jù)關鍵詞、分子式、化合物名稱，或KEGG、CAS、HMP或