實驗五血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳分離

實驗五血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳分離1第1頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2月

電泳技術(shù)--電泳的基本概念和原理一、概念：電泳是指帶電質(zhì)點在電場中向本身所帶電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。二、原理：在一定PH條件下，不同的物質(zhì)具有不同的等電點就帶不同性質(zhì)的電荷，因而在一定的電場中它們的移動方向和移動速度也不同，因此，可使它們分離。質(zhì)點在電場中的移動方向決定于顆粒所帶電荷的種類：帶正電荷的顆粒向電場的負極移動；帶負電荷的顆粒向正極移動；凈電荷為零的顆粒在電場中不移動。顆粒在電場中移動的速度主要決定于顆粒帶電荷的量，同時受顆粒形狀和顆粒相對分子質(zhì)量的大小的影響。2第2頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2月在電場中，顆粒的移動速度，通常用泳動度（或遷移率）來表示。泳動度是帶電顆粒在單位電場強度下的泳動速度即：

vd/tdLμ＝---=-------=----·----EV/LVt

式中：μ－泳動度（即遷移率），cm2/（V·s）；v－泳動速度，cm/s；E－電場強度，V/cm；d－顆粒泳動距離，cm；V－實際電壓，V（伏特）；

t－通電時間，s（秒）；

L－介質(zhì)的有效長度（cm）。通過測量d、L、V、t即可計算出顆粒的泳動度。

在一定條件下，任何帶電顆粒都具有自己特定的泳動度，它是膠體顆粒的一個物質(zhì)常數(shù)，可用其鑒定蛋白質(zhì)等物質(zhì)。3第3頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2月三、影響電泳泳動度的因素：1、顆粒性質(zhì)：顆粒的直徑、形狀及所帶靜電荷量對泳動速度有較大影響。一般來說顆粒帶凈電荷量越多，或其形狀越接近球形，在電場中的泳動速度就越快。反之則越慢。2、電場強度：電場強度是指每一厘米的電位降。又稱為電位梯度或電勢梯度。它對泳動速度起著十分重要的作用。電場強度越高，帶電顆粒的泳動速度越快。反之，則越慢。根據(jù)電場強度（電壓的高低）大小，又可將電泳分為常壓電泳（100－500V）和高壓電泳（500－10000V）。前者電場強度為2－10伏特/厘米，后者為70－200伏特/厘米。常壓電泳多用于分離大分子物質(zhì)。高壓電泳常需要冷卻裝置。高壓電泳時間短，有時僅需數(shù)分鐘，多用于分離小分子物質(zhì)。4第4頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2月3、溶液的性質(zhì)：主要是指電極溶液（緩沖溶液）和蛋白質(zhì)樣品溶液的pH值、離子強度和粘度等。（1）pH值：溶液pH值決定帶電顆粒的解離程度，也即決定其帶凈電荷的量。對蛋白質(zhì)而言，溶液的pH值離其等電點越遠，則其帶凈電荷量就越多，從而泳動速度就越快。反之，則越慢。當(dāng)pH值等于其PI時，凈電荷為0，μ也為0。因此電泳時應(yīng)選擇適宜的PH值，并需采用緩沖溶液，使溶液的pH值恒定。（2）離子強度：溶液的離子強度一般在0.02－0.2之間時，電泳較合適。若離子強度過高，則會降低顆粒的泳動速度。其原因是，帶電顆粒能把溶液中與其電荷相反的離子吸引在自己周圍形成離子擴散層。若離子強度過低，則緩沖能力差，往往會因溶液PH值變化而影響泳動的速率。5第5頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2月離子強度的計算公式為：

I＝1/2Σmizi2=1/2(m1z12+m2z22+…mnzn2)I－溶液的離子強度；

mi－離子的摩爾濃度；

zi－離子的價數(shù)1，2，…n－代表各種離子。（3）溶液粘度：泳動度與溶液粘度是成反比關(guān)系。因此，粘度過大或過小，必然影響泳動度。4、電滲：當(dāng)支持物不是絕對惰性物質(zhì)時，常常會有一些離子基團如羧基、磺酸基、羥基等吸附溶液中的正離子，使靠近支持物的溶液相對帶電。在電場作用下，此溶液層會向負極移動。反之，若支持物的離子基團吸附溶液中的負離子，則溶液層會向正極移動。這種溶液層的泳動現(xiàn)象稱為電滲。6第6頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2月

因此，當(dāng)顆粒的泳動方向與電滲方向一致時，則加快顆粒的泳動速度；當(dāng)顆粒的泳動方向與電滲方向相反時，則降低顆粒的泳動速度。

AB//////////////////////////////////////////

－－－－++++++++++－++++++++++－－－－+A支持物B支持物7第7頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2月5、焦耳熱：在電泳過程中，電流強度與釋放出熱量（Q）之間的關(guān)系可列成如下公式：Q＝I2Rt

式中R為電阻；t為電泳時間；I為電流強度。公式表明，電泳過程中釋放出的熱量與電流強度的平方成正比。當(dāng)電場強度或電極緩沖液中離子強度增高時，電流強度會隨著增大。這不僅降低分辨率，而且在嚴(yán)重時會燒斷濾紙或熔化瓊脂糖凝膠支持物。6、分子篩（篩孔）：支持物瓊脂和聚丙烯酰胺凝膠都有大小不等的篩孔--分子篩，在篩孔大的凝膠中溶質(zhì)顆粒泳動速度快。反之，則泳動速度慢。除上述影響泳動速度的因子外，溫度和儀器裝置等因子的影響也應(yīng)考慮。8第8頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2月四、電泳的分類目前，電泳（electrophoresis）方法大致可分為三類顯微電泳、自由界面電泳（沒有支持物）及區(qū)帶電泳。以區(qū)帶電泳應(yīng)用比較廣泛。顯微電泳是用顯微鏡直接觀察細胞等大顆粒物質(zhì)電泳行為的過程。目前已用于研究膜結(jié)構(gòu)及癌細胞和正常細胞的差異性等方面。自由界面電泳是被分離的溶質(zhì)顆粒經(jīng)電泳后與緩沖溶液之間形成界面的電泳過程。利用適當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)系統(tǒng)可觀察到界面的移動。在電泳過程中，每個移動界面（峰）相當(dāng)于某一特定的蛋白質(zhì)。如：用于血漿蛋白成分的電泳。

9第9頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2月10第10頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2月區(qū)帶電泳（zoneelectrophoresis）是由于在支持物上電泳時各組分因遷移速度不同分布成區(qū)帶而得名。區(qū)帶電泳按其支持物性狀（物理性狀）不同可以分為四類：1、濾紙和薄膜電泳：如醋酸薄膜電泳、聚酰胺薄膜電泳2、粉末電泳：支持介質(zhì)是淀粉、纖維素粉、硅膠粉等，粉末與適當(dāng)?shù)娜軇┱{(diào)和，鋪成平板。3、細絲電泳：如尼龍絲、人造絲電泳。此為微量電泳。4、凝膠電泳：最常用的支持介質(zhì)有：聚丙烯酰胺、瓊脂糖凝膠，凝膠可制作成平板或柱子。11第11頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2月

按儀器裝置形式可分為：

1、平板電泳：將支持物質(zhì)鋪在平板上（玻璃或有機玻璃）進行電泳，此法最為常用。

2、垂直板電泳：將支持物鋪在平板上，作垂直裝置后進行電泳。

3、垂直柱形電泳：將支持物質(zhì)裝在垂直的圓形玻璃柱內(nèi)進行電泳。（圓盤電泳：將支持物質(zhì)裝入同一規(guī)格的玻璃管內(nèi)，在一不連續(xù)系統(tǒng)中進行電泳，樣品分離后的區(qū)帶類似圓盤。）

12第12頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2月血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳法分離

實驗?zāi)康?掌握醋酸纖維薄膜電泳法分離蛋白質(zhì)

的原理和方法。

13第13頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2月相關(guān)知識血清蛋白

蛋白質(zhì)名稱等電點（pI）相對分子質(zhì)量白蛋白α1－球蛋白α2－球蛋白β－球蛋白γ－球蛋白4.85.065.065.126.85~7.56900020000030000090000~150000156000~30000014第14頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2月

血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳一、原理：采用醋酸纖維薄膜作為支持物的電泳方法稱為醋酸纖維素薄膜電泳。醋酸纖維素是纖維素的羥基乙?；纬傻睦w維素醋酸酯。將它溶于有機溶劑（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均勻的薄膜則成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀的結(jié)構(gòu)，厚度約為120微米，有很強的通透性，對分子移動阻力很小。醋酸纖維素薄膜電泳具有微量、快速、簡便、分辨力高，對樣品無拖尾和吸附現(xiàn)象等優(yōu)點。已廣泛應(yīng)用于科學(xué)實驗、生化產(chǎn)品分析和臨床化驗，如：血清蛋白、血紅蛋白、脂蛋白、球蛋白、糖蛋白等的分離和鑒定。二、操作要點15第15頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）儀器與薄膜的準(zhǔn)備：1、醋酸纖維薄膜的潤濕和選擇：將醋酸纖維薄膜條浸于盛有巴比妥緩沖液的培養(yǎng)皿中，用鑷子輕壓，使它全部浸入緩沖液內(nèi)，待膜完全浸透（約半小時）后取出，夾在清潔的濾紙中間，輕輕吸去多余的緩沖液，同時分辨出光澤面和無光澤面，并用鉛筆在無光澤面上作記號。2、制作“濾紙橋”。（二）點樣：將此血清涂在薄載玻片的一端截面上，然后輕輕與距纖維薄膜一端2cm處接觸，樣品即呈一條帶狀滲透在纖維薄膜上。切不可用力過大把薄膜弄破。將薄膜平貼在濾紙橋上，點樣端放在陰極，加蓋密封平衡十分鐘。

（三）電泳：電壓穩(wěn)定在100～120V，時間45～60分鐘，待電泳區(qū)帶展開約3～3.5cm后關(guān)閉電源。16第16頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）染色：電泳完畢后立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5～10分鐘。然后，用漂洗液浸洗，每10分鐘左右換一次漂洗液，連續(xù)更換3～5次，至背景無色為止。染色完后將薄膜夾在干凈的濾紙中，吸去多余的溶液。（五）結(jié)果判斷：一般在染色后的薄膜上可顯現(xiàn)清楚的五條區(qū)帶。從正極端起，依次為清蛋白，α1球蛋白，α2球蛋白，β球蛋白，γ球蛋白。

17第17頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2月

A清蛋白

12清蛋白

12B血清蛋白電泳圖譜18第18頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2