第二章-細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)-課件

?

細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)

–原則防止微生物污染和有害因素影響

劃分不同功能區(qū)或用鋁合金隔板隔開無菌操作區(qū)應(yīng)在室內(nèi)較少走動(dòng)的內(nèi)側(cè)清洗和消毒安置在另室–要求工作環(huán)境清潔、空氣清新、干燥和無煙塵1ppt課件◆動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)置準(zhǔn)備室無菌間操作間培養(yǎng)室分析室2ppt課件◆溫度：一般控制在在25±2oC◆光照：光強(qiáng)、光質(zhì)、光照時(shí)間3ppt課件一、動(dòng)植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室通用儀器設(shè)備超凈工作臺(tái)n超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。4ppt課件冰箱■普通冰箱（4℃，－20

℃）■低溫冰箱（－20℃）■超低溫冰箱（－80℃）5ppt課件電熱干燥箱■烘干和干熱滅菌玻璃器皿■100度以下時(shí)再打開箱門■金屬器械、塑料制品、橡膠等不能在干燥箱內(nèi)消毒

6ppt課件壓力蒸汽消毒器濕熱滅菌，用途廣7ppt課件n使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意n

CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37

℃％CO

2

。，5

的問題：

①用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。 ②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90

℃，14

h)。 ③箱內(nèi)滅菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。

8ppt課件細(xì)胞冷凍儲(chǔ)存器

——液氮罐液氮溫度：－196℃不斷揮發(fā)，及時(shí)補(bǔ)充9ppt課件3.1

細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室條件

◆實(shí)驗(yàn)室基本組成 ◆實(shí)驗(yàn)用品與主要設(shè)備◆實(shí)驗(yàn)室的生物安全10ppt課件?

?

?

?

生物安全防護(hù)水平（BSL）

由一級(jí)防護(hù)屏障（安全設(shè)備）和二級(jí)防護(hù)屏障（實(shí)驗(yàn)室設(shè)施）組合構(gòu)成四級(jí)生物安全水平。

一級(jí)生物安全防護(hù)水平

（BSL－1）二級(jí)生物安全防護(hù)水平

（BSL－2）三級(jí)生物安全防護(hù)水平

（BSL－3）四級(jí)生物安全防護(hù)水平（BSL－4）11ppt課件生物安全四級(jí)(BSL—4)：處理特別危險(xiǎn)的傳染源生物安全一級(jí)(BSL-1)：適合于非常熟悉的病源，不會(huì)經(jīng)常引發(fā)健康成人疾病，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員和環(huán)境潛在危險(xiǎn)小。一般也不使用特殊的遏制設(shè)備和設(shè)施。生物安全二級(jí)(BSL—2)：適合于對(duì)人和環(huán)境有中度潛在危險(xiǎn)的病源，應(yīng)在生物安全柜中或其它物理遏制設(shè)備中進(jìn)行。生物安全三級(jí)(BSL—3)：該會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的、可能致死的疾病的病源。在生物安全柜或其他物理遏制裝置中進(jìn)行，或由穿戴合適防護(hù)服及設(shè)施的實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過特殊設(shè)計(jì)和施工。12ppt課件Summary：細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件細(xì)胞保存條件：液氮罐無菌條件：凈化工作室，高效過濾器，生物安全柜，超凈工作臺(tái)，紫外燈，電熱干燥箱，濾器，高壓滅菌器，抗生素細(xì)胞生長條件：純水蒸餾器，純水儀，培養(yǎng)板，培養(yǎng)瓶，CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基，血清細(xì)胞檢測條件：倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀，微孔板震蕩器，高速離心機(jī)，移液器實(shí)驗(yàn)室安全：生物實(shí)驗(yàn)室安全，P1,P2,P3實(shí)驗(yàn)室安全13ppt課件Chapter

3

細(xì)胞工程基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)◆實(shí)驗(yàn)室設(shè)施與基本條件◆無菌技術(shù)◆顯微技術(shù)◆細(xì)胞觀察與分析◆細(xì)胞分離◆細(xì)胞保存與復(fù)蘇14ppt課件3.2

無菌技術(shù)◆培養(yǎng)用品清洗◆滅菌方法◆污染檢測與控制15ppt課件一、玻璃器皿的清洗◆浸泡新瓶使用前用自來水簡單刷洗，后用稀鹽酸浸泡過夜。WHY?

于6使用過的器皿應(yīng)立即浸入水中，避免干涸難洗◆刷洗軟毛刷沾洗滌劑洗滌

◆浸酸關(guān)鍵一環(huán)。時(shí)間不少于小時(shí)，一般過夜。清潔液變綠應(yīng)重新配制?！魶_洗洗滌裝置與手工◆烘干、包裝、高壓（15磅20分鐘）或干熱（160度2小時(shí)）16ppt課件17ppt課件◆常規(guī)清洗方法：水中浸泡自來水沖洗洗2-3次

1%鹽酸浸泡30分鐘晾干 包裝、高壓滅菌

二、膠塞的清洗◆新購置膠塞有大量滑石粉，用自來水洗凈，再常規(guī)處理2%NaOH煮沸10-20分鐘自來水沖洗蒸餾水清18ppt課件三、包裝消毒筒●局部包裝◆包裝材料有皺紋包裝紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒及金屬●全包裝小物品裝飯盒，注意期限，標(biāo)明物品名。吸管用脫脂棉將管接口端堵塞，裝入消毒筒，筒底墊棉花19ppt課件

3.2

無菌技術(shù)◆培養(yǎng)用品清洗◆滅菌方法◆污染檢測與控制20ppt課件?

操作人員的手部？

?

實(shí)驗(yàn)室桌面、地面等？細(xì)胞培養(yǎng)室中下列物品該如何消毒？?

玻璃培養(yǎng)瓶，移液管，

試管等玻璃器皿？?

超凈工作臺(tái)臺(tái)面？

?

金屬手術(shù)器械？?

不耐熱的液體培養(yǎng)基和胰蛋白酶等

？?

橡膠塞和塑料瓶蓋等？

?

細(xì)胞培養(yǎng)室？

21ppt課件消毒（1）

物理消毒

?

火焰

?

射線消毒：鈷60（60Co

），用于牛血清、塑料制品

?

紫外線消毒空氣、操作臺(tái)表面

。紫外燈距地面2.5米

?

干熱消毒玻璃器皿

160

度保持90-120分鐘

?

濕熱消毒布類、膠塞、金屬器械、玻璃器皿某些液布

體物品不宜過滿液體和橡膠制品10磅10分鐘 類、金屬器械、玻璃器皿

15磅20分鐘

?

濾過消毒培養(yǎng)用液

0.22

μm微孔濾膜22ppt課件消毒（2）化學(xué)消毒

?

來蘇爾（煤酚皂）

?

0.1%新潔爾滅

?

70％（或75％）酒精

?

0.5過氧乙酸抗生素消毒氣體消毒：37％甲醛加熱沸騰后，加適量高錳酸鉀，關(guān)門窗1～3天煮沸消毒23ppt課件物品濕熱干熱過濾培養(yǎng)室工作臺(tái)玻璃制品＋＋＋＋金屬器械塑料制品＋橡膠制品培養(yǎng)用液布類棉類＋＋＋＋紫外化學(xué)氣體消毒劑電離輻射＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋24ppt課件

消毒與滅菌重要概念1.消毒2.滅菌3.防腐4.無菌

殺死物體上病原微生物的方法；并不一定能 殺死含芽胞的細(xì)菌或非病原微生物 殺死物體上所有微生物的方法。防止或抑制微生物生長繁殖的方法。 不存在活的微生物。5.無菌操作防止微生物進(jìn)入機(jī)體或局部環(huán)境的操作技術(shù)。25ppt課件一、物理消毒滅菌法（一）熱力滅菌法1.濕熱滅菌法2.干熱滅菌法26ppt課件蛋白質(zhì)含水量（%）

50

25

凝固所需溫度

56

18

6

0

76

80-90

145

160-170

結(jié)論一：蛋白質(zhì)在濕熱中較易凝固變性

。27ppt課件熱型

溫度（度）時(shí)間 （h)

干熱

130-140

4

濕熱

105.3

3

布層內(nèi)溫度

20層

40層

100層滅菌效 果

86

72

70.5

不完全

101

101

101

完全

結(jié)論二：濕熱的穿透力比干熱強(qiáng)。28ppt課件

一、物理消毒滅菌法（一）熱力滅菌法

煮沸法 流通蒸汽消毒法1.濕熱滅菌法

2.干熱滅菌法間歇滅菌法巴氏消毒法高壓蒸汽滅菌法 干烤法 焚燒法 燒灼法29ppt課件

方法名煮沸法

方法內(nèi)容100度

5min

間歇滅菌法

流通蒸汽消毒法

100度

10-30min

100度

10-30min

,37

巴氏消毒法

61.1-62.8度

30min

71.7度

15-30s

高壓蒸汽滅菌法

121度20-40min

焚燒法燒灼法干烤法

160度

2小時(shí)

適用物質(zhì)飲水和一般器械的消毒

耐濕不耐高溫物品的消毒

度過夜，每日一次，不耐高溫的營養(yǎng)物

連續(xù)三次牛奶和酒類等

耐高溫、耐水物品無經(jīng)濟(jì)價(jià)值的污染物品微生物實(shí)驗(yàn)室的接種針等不怕熱的金屬器械玻璃器皿、瓷器等滅菌30ppt課件1.日光與紫外線殺菌波長：210-300nm最適波長：265-266nm殺菌機(jī)制：干擾DNA復(fù)制特點(diǎn)：穿透力弱（二）輻射殺菌法2.電離輻射應(yīng)用：不耐熱的塑料制品以及食品消毒應(yīng)用：空氣和物體表面的消毒缺點(diǎn)：損傷皮膚和眼睛種類：γ射線、χ射線和電子流滅菌機(jī)制：產(chǎn)生游離基，破壞壞DNA特點(diǎn)：具有較高的能量和穿透力31ppt課件（三）過濾除菌法（四）超聲波殺菌法（五）干燥和低溫抑菌法負(fù)壓？正壓？32ppt課件二、化學(xué)消毒滅菌法（一）消毒劑的主要種類（二）消毒劑的應(yīng)用33ppt課件類別作用機(jī)制常用消毒劑用途酚類蛋白質(zhì)變性、損傷細(xì)胞膜、滅活酶類3%～5%石炭酸或或2%來蘇兒地面、器具表面的消毒0.01%～0.05%洗必泰皮膚消毒，術(shù)前洗手、陰道沖洗等醇類蛋白質(zhì)變性與凝固、干擾代謝70%～75%乙醇50%～70%異丙醇皮膚、溫度計(jì)消毒重金屬鹽類氧化作用、蛋白質(zhì)變性與沉淀,滅活酶類0.05%～0.1%升汞非金屬器皿的消毒0.1%硫柳汞皮膚、粘膜、小創(chuàng)傷消毒1%硝酸銀1%～5%蛋白銀新生兒滴眼，預(yù)防淋病奈瑟菌感染氧化劑氧化作用、蛋白質(zhì)沉淀0.1%高錳酸鉀皮膚、尿道、蔬菜、水果消毒3%過氧化氫創(chuàng)口、皮膚粘膜消毒0.2%～0.3%過氧乙酸塑料、玻璃器材消毒2.0%～2.5%碘酒皮膚消毒0.2～0.5ppm氯飲水及游泳池消毒10%～20%漂白粉地面、廁所與排泄物消毒34ppt課件類別作用機(jī)制常用消毒劑用途氧化劑氧化作用、蛋白質(zhì)沉淀4ppm二氯異氰尿酸鈉水消毒3%二氯異氰尿酸鈉空氣及排泄物消毒0.2%～0.5%氯胺室內(nèi)空氣及表面消毒表面活性劑損傷細(xì)胞膜、滅活氧化酶等酶活性、使蛋白質(zhì)沉淀0.05%～0.1%新潔爾滅外科手術(shù)洗手，皮膚粘膜消毒，浸泡手術(shù)器械0.05%～0.1%杜滅芬塑料、橡皮類消毒烷化劑菌體蛋白質(zhì)及核酸烷基化10%甲醛物體表面消毒,空氣消毒50mg/L環(huán)氧乙烷手術(shù)器械、敷料等消毒2%戊二醛精密儀器、內(nèi)窺鏡等消毒染料抑制細(xì)菌繁殖，干擾氧化過程2%～4%龍膽紫淺表創(chuàng)傷消毒酸堿類破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，蛋白質(zhì)凝固

335ml/m～10ml/m10ml/m醋酸加等量水蒸發(fā)空氣消毒生石灰(按11∶4～1∶8比例加水配成糊狀狀)地面、排泄物消毒皮膚創(chuàng)傷沖洗，金屬器械、35ppt課件（三）影響消毒滅菌效果的因素1.影響因素（1）消毒劑的性質(zhì)、濃度與作用時(shí)間36ppt課件（三）影響消毒滅菌效果的因素1.影響因素（1）消毒劑的性質(zhì)、濃度與作用時(shí)間（2）微生物的污染程度（3）微生物的種類和生活狀態(tài)（4）環(huán)境中有機(jī)物（5）溫度、濕度、酸堿度（6）化學(xué)拮抗物2.注意事項(xiàng)37ppt課件2.注意事項(xiàng)①嚴(yán)格掌握所用消毒劑的濃度、消毒時(shí)間與使用方法。②使用新鮮配制的消毒劑。③消毒劑應(yīng)置于消毒過的清潔容器內(nèi)貯放備用。④待消毒物品須洗刷干凈，去除油污及血、膿等有機(jī)物方可消毒。⑤揮發(fā)性消毒液應(yīng)貯放在有蓋容器內(nèi)，并定期測量比重。38ppt課件◆新玻璃器皿的洗滌與消毒毒.wmv◆舊玻璃器皿的洗滌與消毒毒.wmv◆金屬器械的洗滌與消毒毒.wmv◆橡膠塑料的洗滌與消毒毒.wmv39ppt課件◆無菌操作成功或失敗的首要條件無菌操作技術(shù)要領(lǐng)?操作野消毒

?洗手和著裝

?火焰消毒◆培養(yǎng)前準(zhǔn)備操作卡片

用品置于場地，然后消毒40ppt課件?動(dòng)作準(zhǔn)確敏捷

?不用手觸及已消毒物品

?操作面布局合理

?操作保持一定順序

?培養(yǎng)用瓶和吸管的放置

?防止各種用液的交叉污染

?不向操作野講話或咳嗽41ppt課件42ppt課件43ppt課件

3.2

無菌技術(shù)◆培養(yǎng)用品清洗◆滅菌方法◆污染檢測與控制44ppt課件一、污染途徑◆空氣◆器材清洗消毒不徹底◆操作◆血清◆組織45ppt課件戰(zhàn)-二、污染對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的影響及檢測

最嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)

污染

(contamination)

細(xì)胞培養(yǎng)的污染問題十分重要，一旦發(fā)生污染，將導(dǎo)致前功盡棄。所以細(xì)胞培養(yǎng)一定要建立無菌觀念。遇到培養(yǎng)污染要分析原因，及時(shí)處理。46ppt課件

細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染物有細(xì)菌、酵母菌、真菌、支原體和病毒等。在出現(xiàn)以下情況時(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞可能有污染

：1)

培養(yǎng)液的酸堿度發(fā)生異常的改變

。2)

培養(yǎng)液出現(xiàn)混濁。

3)

光鏡觀察到菌絲和顆粒

。4)

細(xì)胞出現(xiàn)死亡或增殖緩慢等。47ppt課件細(xì)菌污染

?培養(yǎng)液渾濁

?鏡下可見菌體48ppt課件真菌污染

?大多呈白色或淺黃色小點(diǎn)漂浮于培養(yǎng)液表面

?鏡下呈絲狀、管狀或樹枝狀，縱橫交錯(cuò)49ppt課件50ppt課件51ppt課件支原體污染

?最常見、不易察覺

?大小介于0.2-2μm，

約1%可通過濾菌器?對(duì)酸耐受性差，對(duì)熱較敏感

，青霉素?zé)o效?“正?！备杏X

?腺苷酸環(huán)化酶

?精氨酸

?檢測52ppt課件◆支原體檢測:

支原體污染細(xì)胞后，能抑制細(xì)胞代謝和生長，改變核酸合成，影響細(xì)胞的抗原性，引起細(xì)胞染色體改變，干擾擾DNA的復(fù)制，以及具有類病毒作用。在培養(yǎng)細(xì)胞初期，由于支原體對(duì)細(xì)胞的繁殖影響較小而往往被忽略。53ppt課件支原體檢測方法和處理

2）直接培養(yǎng)法：實(shí)驗(yàn)室常用。

3）放射自顯影檢測：

4）DNA分子雜交：檢測完畢后，所有實(shí)驗(yàn)用具均應(yīng)經(jīng)過高壓消毒處理1)熒光技術(shù)檢測：支原體含有

DNA,能與一種熒光染料Hoechest

33258特異性的結(jié)合，可根據(jù)細(xì)胞表面的熒光來顯示細(xì)胞是否污染有支原體。

54ppt課件支原體污染電鏡照片（×30K）55ppt課件病毒的污染及檢測

2）血細(xì)胞吸附試驗(yàn)；

3）雞胚接種。1）致細(xì)胞病變效應(yīng)（

Cytopathic

effect,

CPE）或集落的檢測：采用相差顯微 鏡檢測

56ppt課件57ppt課件細(xì)胞間交叉污染瓶內(nèi)；為避免細(xì)胞間交叉污染，應(yīng)注意：◆了解各細(xì)胞系的特征；◆培養(yǎng)各細(xì)胞系的操作手續(xù)要快速；◆培養(yǎng)各細(xì)胞系不用同一瓶的培養(yǎng)液和酶等；◆吸過培養(yǎng)液和細(xì)胞懸液的吸管，不能放回儲(chǔ)存培養(yǎng)液和酶的◆經(jīng)常檢查培養(yǎng)物特征，注意任何突然的形態(tài)學(xué)改變，通過染色體或同工酶譜分析，檢查是否有交叉污染。58ppt課件三、污染的預(yù)防)?消毒(Sterilization

)?無菌操作(Aseptic

technique

59ppt課件四、污染的排除

?：v抗生素處理：v動(dòng)物體內(nèi)接種除菌法：受支原體污染的腫瘤細(xì)胞可接種到動(dòng)v加溫除菌：支原體熱耐受性差，可把污染的細(xì)胞41度處理5～10小時(shí)，以殺滅支原體，但對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞本身也有很大影響。v共培養(yǎng)法：從動(dòng)物腹腔采集巨噬細(xì)胞，與污染細(xì)胞共培養(yǎng)。v重新克隆法：抗生素處理后，將細(xì)胞稀釋后傳代，每周換2次含抗生素的新鮮培養(yǎng)液，4～5周后，重復(fù)克隆2次。物皮下或腹腔中，借助動(dòng)物的免疫系統(tǒng)殺滅支原體。60ppt課件?

被毛生長異常，呈裸體外表。：T裸小鼠（nudemice）：淋巴細(xì)胞功能缺陷動(dòng)物?

即先天性無胸腺裸小鼠，由11號(hào)染色體上nu隱性基因突變導(dǎo)致。?

無胸腺，僅有胸腺殘跡或異常胸腺上皮，不能使T-cell正常分化，

導(dǎo)致細(xì)胞免疫力低下。幼齡鼠有殘存的未分化的上皮細(xì)胞。?B細(xì)胞功能正常，NK細(xì)胞活力增強(qiáng)。?

繁育能力差，乳腺發(fā)育缺損，以雄性純合子與雌性雜合子繁育。?T細(xì)胞缺陷可通過移植成熟T細(xì)胞、胸腺細(xì)胞或正常胸腺上皮得 到校正。61ppt課件62ppt課件分別為青霉素（單位/ml和鏈霉素（可配（

為防止污染，細(xì)胞培養(yǎng)液中常添加青霉素和鏈霉素，即所謂“雙抗”，二者的常用終濃度）單位/ml和鏈霉素（）微克/ml。假設(shè)每100ml培養(yǎng)基加50ul

“雙抗”就可達(dá)到終濃度，母液濃度應(yīng)配成：青霉素（））微克/ml。P每瓶80萬U，）ml母液？相應(yīng)加入（）克S？63ppt課件Chapter

3

細(xì)胞工程基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)◆實(shí)驗(yàn)室設(shè)施與基本條件◆無菌技術(shù)◆顯微技術(shù)◆細(xì)胞觀察與分析◆細(xì)胞分離◆細(xì)胞保存與復(fù)蘇64ppt課件◆

Light

microscopy

◆

Electron

microscopy

◆

Scanning

tunneling

microscope

◆

Micromanipulation

technique

3.3

顯微技術(shù)

65ppt課件二、培養(yǎng)細(xì)胞的觀察方法

細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中需要每天進(jìn)行常規(guī)檢查和顯微鏡觀察，及時(shí)了解細(xì)胞生長狀態(tài)、數(shù)量改變、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞有無移動(dòng)、有無污染、培養(yǎng)液pH是否變酸、變黃是否更換等。

由于細(xì)胞小而復(fù)雜，若不借助適當(dāng)?shù)氖侄?，則難以觀察其形態(tài)、結(jié)構(gòu)，更難發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)各種組分的分子組成及功能。目前，已有多種研究細(xì)胞的技術(shù)，從光鏡到電子顯微鏡，從一般細(xì)胞化學(xué)法到免疫化學(xué)法等。66ppt課件1.

肉眼觀察

變淺變黃。

?

肉眼觀察培養(yǎng)液的顏色和

透明度的變化。?

正常情況下，培養(yǎng)液pH介于7.2～7.4之間，呈桃紅色清亮透明。（指示劑：

酚紅）?

培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞代謝會(huì)使培養(yǎng)液pH值下降，引起顏色?

發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液變黃，應(yīng)及時(shí)換液傳代。一般生長穩(wěn)定 的細(xì)胞2～3天換液一次，生長緩慢的細(xì)胞3～4天換 液一次。67ppt課件

酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為為PH值的指示劑:中性時(shí)為 紅色,酸性時(shí)為黃色,堿性時(shí)為紫色。

苯酚紅

Phenol

red

別名：酚紅；苯酚磺酞；Phend-

-sulphonphthalein

分子式：C19H1405S

相對(duì)分子質(zhì)量：354．38

性狀:

紅色結(jié)晶性粉末。微溶于水，易溶于乙醇及堿溶液， 不溶于三氯甲烷及醚。溶于稀堿溶液呈紅色。

用途：酸堿指示劑，pH值1.2（橙）～3.0(黃），6.5（棕 黃）～8.0(紫紅）問題：細(xì)胞培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基會(huì)逐漸變黃，為什么？培養(yǎng)基如果暴露在空氣中會(huì)逐漸變紫

，為什么？（page45）68ppt課件?

生長良好的細(xì)胞，在顯微鏡下可觀察到細(xì)胞透明度2.

顯微鏡觀察

大，折光性強(qiáng)，輪廓不清

。?

相差顯微鏡觀察時(shí)可見細(xì)胞部分細(xì)微結(jié)構(gòu)

。?

若細(xì)胞生長狀態(tài)不良，可見細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，細(xì)胞折 光性變?nèi)?，胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物 質(zhì)，細(xì)胞之間空隙增大，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，甚至失 去原有細(xì)胞的特點(diǎn)，產(chǎn)生圓縮脫落，有時(shí)細(xì)胞表面 及周圍出現(xiàn)絲絮狀物。發(fā)現(xiàn)這種情況應(yīng)及時(shí)處理。69ppt課件◆倒置顯微鏡70ppt課件培養(yǎng)的CHO細(xì)胞71ppt課件◆相差顯微鏡72ppt課件相差顯微鏡的結(jié)構(gòu)?

相差顯微鏡由相差聚光器和相差接物鏡兩個(gè)主要部分 組成。它與普通光鏡相比多了兩個(gè)部件，一個(gè)是在聚 光器上增加一個(gè)環(huán)形光闌，使透過聚光器的光線形成 空心光錐、聚焦到標(biāo)本上。另一個(gè)是在物鏡的后焦面 增加一個(gè)相板，相板有一個(gè)環(huán)形區(qū)，其大小恰好通過 環(huán)形光闌束的直射光，相板各區(qū)鍍以不同物質(zhì)，使得 通過環(huán)形區(qū)的光比通過相板其他部位的光超前或滯后

1/4λ

73ppt課件相差顯微鏡的基本原理

?

把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了 各種結(jié)構(gòu)之間的對(duì)比度，使標(biāo)本的各種結(jié)構(gòu)變得更清晰 可見。光線透過標(biāo)本后，發(fā)生折射，偏離了未通過標(biāo)本 的光線的光路，這兩組光線合軸后，則發(fā)生相互干涉現(xiàn) 象。透過生物標(biāo)本發(fā)生折射的光線與未透過標(biāo)本的光線 之間產(chǎn)生了光程差。前者被阻滯了1/4λ(波長)。如果把 光程差再增加1/4λ，則變?yōu)?/2λ，合軸后兩束光線的干 涉加強(qiáng)，使標(biāo)本周圍發(fā)生暈圈，提高了可見度。74ppt課件相差顯微鏡觀察活細(xì)胞的步驟

?

首先調(diào)好相位板，使聚光器相位板號(hào)與接物鏡放大倍數(shù)

(相位板)相一致。然后抽出接目鏡，再換輔助望遠(yuǎn)鏡， 移動(dòng)輔助鏡筒并調(diào)整聚光器相位板，使視影中兩個(gè)大小 一樣的光環(huán)相互吻合。再重新?lián)Q上原接目鏡，即成相差 圖像。當(dāng)更換不同倍數(shù)接物鏡時(shí)，需按上述過程重新調(diào) 節(jié)。75ppt課件?

用相差顯微鏡觀察細(xì)胞應(yīng)注意瓶（或皿）的厚度、均勻 性、清潔度、氣溫等。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶 （或皿）一般成像效果都較好，但反復(fù)刷洗過的玻璃或 塑料器皿將嚴(yán)重影響分辨力。天氣較冷時(shí)，若與顯微鏡 觀察處溫差較大，由于溫差使培養(yǎng)瓶內(nèi)壁形成霧滴而影 響觀察的清晰度，此時(shí)可輕輕將瓶傾斜使瓶內(nèi)培養(yǎng)液浸 潤內(nèi)壁，以得到好的相差像。若對(duì)原代細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行相 差顯微照相，最好選擇換液后進(jìn)行，這樣可以去除漂浮 的組織塊和死細(xì)胞，提高成像清晰度。觀察細(xì)胞時(shí)要有 無菌概念，動(dòng)作要輕，避免猛烈振蕩。觀察時(shí)間不要太 長，觀察次數(shù)也不要太頻繁，以免影響細(xì)胞生長。76ppt課件77ppt課件78ppt課件思考提示：（1）細(xì)胞形態(tài)的觀察手段和觀察指標(biāo) （2）檢測細(xì)胞生長增殖狀態(tài)的手段和指標(biāo)某種藥物（或向細(xì)胞中轉(zhuǎn)入某個(gè)新基因；或抑制細(xì)胞中某個(gè)原有基因的表達(dá)后）對(duì)培養(yǎng)的某種腫瘤細(xì)胞的形態(tài)和生長增殖的影響。79ppt課件Chapter

3

細(xì)胞工程基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)◆實(shí)驗(yàn)室設(shè)施與基本條件◆無菌技術(shù)◆顯微技術(shù)◆細(xì)胞觀察與分析◆細(xì)胞分離◆細(xì)胞保存與復(fù)蘇80ppt課件三、培養(yǎng)細(xì)胞的檢測指標(biāo)

1.

細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞生長狀況有關(guān)指標(biāo)的檢測方法81ppt課件Cell

counting

using

a

haemocytometer82ppt課件83ppt課件1毫升＝1立方厘米

計(jì)數(shù)原則：

不數(shù)死細(xì)胞（染 藍(lán)）、壓線細(xì)胞數(shù) 上不數(shù)下，數(shù)左不 數(shù)右，一團(tuán)細(xì)胞按 一個(gè)計(jì)數(shù)！

1毫米細(xì)胞數(shù)/毫升細(xì)胞懸液＝4大格細(xì)胞總數(shù)

/4×10000×稀釋倍數(shù)

視頻：細(xì)胞計(jì)數(shù).wmv84ppt課件2.

細(xì)胞生長曲線三、培養(yǎng)細(xì)胞的檢測指標(biāo)如何作？page73

85ppt課件◆生長曲線是培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一，是測定細(xì)胞絕對(duì)生長數(shù)的常用方法，也是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)?！舫Ｓ糜跍y定藥物等外來因素對(duì)細(xì)胞生長的影響！86ppt課件三、培養(yǎng)細(xì)胞的檢測指標(biāo)

3.

細(xì)胞分裂指數(shù)

?

細(xì)胞分裂指數(shù)是表示細(xì)胞增殖旺盛程度的指標(biāo)。它以被測1000個(gè)細(xì)胞中的分裂細(xì)胞數(shù)來計(jì)算。其方法為：用秋水仙素將細(xì)胞處理1～2小時(shí)后，按染色體制片法制片并染色，計(jì)算1000個(gè)細(xì)胞中分裂相的數(shù)目，重復(fù)4次取平均值，用百分比表示。87ppt課件基本步驟：

(1)細(xì)胞準(zhǔn)備用蓋片(支持物)培養(yǎng)法

。(2)每24小時(shí)取出一個(gè)小玻片，按常規(guī)方法進(jìn)行固定，吉姆薩或HE染色，封片，制成永久標(biāo)本

。(3)顯微鏡下選擇細(xì)胞密度適中的區(qū)域觀察分裂細(xì)胞并計(jì) 數(shù)。逐個(gè)視野進(jìn)行，對(duì)每一時(shí)間組的玻片各取細(xì)胞多、 中、少3個(gè)區(qū)域各一區(qū)，共數(shù)1000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算出平均 分裂相值所占百分比。觀察時(shí)要掌握好分裂相標(biāo)準(zhǔn)，主 要是確定好劃分間期和前期，末期和間期等的界限，以 減少誤差。細(xì)胞分裂指數(shù)=細(xì)胞分裂相數(shù)/細(xì)胞總數(shù)(1000)×100088ppt課件4.

細(xì)胞貼壁率三、培養(yǎng)細(xì)胞的檢測指標(biāo)

細(xì)胞貼壁率又稱細(xì)胞接種存活率。它是細(xì)胞被制成分散的懸液后，以低密度(2～5個(gè)細(xì)胞/cm2)被接種到底物上，貼壁并能存活生長形成細(xì)胞小群(克隆)的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)值，用以表示細(xì)胞的生存能力和細(xì)胞群的活力。89ppt課件

基本步驟：（1）取對(duì)生長期細(xì)胞，用消化法制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后 按檢測細(xì)胞生長曲線的接種細(xì)胞的原則，將細(xì)胞接種 于培養(yǎng)瓶(濃度相對(duì)高些)。接種12～15瓶。（2）每2小時(shí)取出一瓶細(xì)胞，倒掉培養(yǎng)液，然后加入胰 酶消化已貼壁細(xì)胞，計(jì)數(shù)已貼壁細(xì)胞，用下面公式逐個(gè)計(jì)算每個(gè)時(shí)間上的貼壁率。每2小時(shí)一次，共觀察24

小時(shí)即12。接種存活率%(貼壁率)=(貼壁存活細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%90ppt課件三、培養(yǎng)細(xì)胞的檢測指標(biāo)

5.

克隆形成率

?

細(xì)胞接種存活率只表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞數(shù)，但貼壁后的細(xì)胞不一定每個(gè)都能增殖和形成克隆。而形成克隆的細(xì)胞必為貼壁和有增殖活力的細(xì)胞。克隆形成率反映細(xì)胞群體依賴性和增殖能力兩個(gè)重要性狀。由于細(xì)胞生物學(xué)性狀不同，細(xì)胞克隆形成率差別也很大，一般初代培養(yǎng)細(xì)胞克隆形成率弱，傳代細(xì)胞系強(qiáng)；二倍體細(xì)胞克隆形成率弱，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系強(qiáng)；正常細(xì)胞克隆形成率弱，腫瘤細(xì)胞強(qiáng)。并且克隆形成率與接種密度有一定關(guān)系，做克隆形成率測定時(shí)，接種細(xì)胞一定要分散成單細(xì)胞懸液，直接接種在碟皿中，持續(xù)一周，隨時(shí)檢查，到細(xì)胞形成克隆時(shí)終止培養(yǎng)。91ppt課件平板克隆形成試驗(yàn)基本步驟：

(1)取對(duì)數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消 化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，把細(xì)胞懸浮在

10%胎牛血清的

RPMI1640培養(yǎng)液中備用。

(2)將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，以適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度(根 據(jù)增殖能力)接種于培養(yǎng)皿中

。一般分每皿50、100、

200個(gè)細(xì)胞的梯度密度分別接種含10mL

37℃預(yù)溫培 養(yǎng)液的皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，

使細(xì)胞分散均勻。置37℃ 5%

CO2及飽和濕度的環(huán)境下，靜置培養(yǎng)2～3周。92ppt課件克隆數(shù)接種細(xì)胞數(shù)(3)經(jīng)常觀察，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止

培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS

小心浸洗2次。加純甲醇或

1:3醋酸/甲醇5mL，固定15

分鐘。然后去固定液，加適

量Giemsa應(yīng)用染色液染10

～30分鐘，然后用流水緩慢 洗去染色液，空氣干燥。

(4)將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片

，用肉眼直 接計(jì)數(shù)克隆，或在顯微鏡(低倍鏡)計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的 克隆數(shù)。最后計(jì)算克隆形成率。

克隆形成率=

—————

×100%

93ppt課件?

平板克隆形成試驗(yàn)方法簡單，適用于貼壁生長

的細(xì)胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗(yàn) 成功的關(guān)鍵是細(xì)胞懸液的制備和接種密度。細(xì) 胞一定要分散得好，不能有細(xì)胞團(tuán)，接種密度 不能過大。94ppt課件

軟瓊脂培養(yǎng)克隆形成試驗(yàn)

基本步驟：

(1)取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25%

胰蛋白酶消化并輕輕吹打，

使之成為單細(xì)胞，作活細(xì)胞計(jì)數(shù)

，用含20%胎牛血清的

DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1×10

6

細(xì)胞/L。然后根據(jù) 實(shí)驗(yàn)要求作梯度倍數(shù)稀釋。

(2)用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個(gè)濃度的低溶點(diǎn)瓊 脂糖液，高壓滅菌后，維持在40℃中不會(huì)凝固。95ppt課件(3)按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和

2×DMEM培養(yǎng)基(含有

2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直徑6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷卻凝固，

可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用

。(4)按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基在無菌 試管中相混以后，再向管中加入0.2mL的細(xì)胞懸液，充 分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙 瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37℃5%CO2溫箱中 培養(yǎng)10～14天。

(5)把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細(xì)胞克隆數(shù)。計(jì)算 形成率。96ppt課件

?

軟瓊脂培養(yǎng)法常用檢測腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。 試驗(yàn)中瓊脂與細(xì)胞相混時(shí)

，瓊脂溫度不宜超過40

℃。接種細(xì)胞的密度每平方厘米不超過35

個(gè)，

一般6cm的平皿接種1000

個(gè)細(xì)胞。正常細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下不能增殖，不適用于軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)。97ppt課件5.

細(xì)胞周期

三、培養(yǎng)細(xì)胞的檢測指標(biāo)

mitoses，PLM）：

?

標(biāo)記有絲分裂百分率法（percentage

labeled

?

對(duì)測定細(xì)胞進(jìn)行脈沖標(biāo)記、定時(shí)取材、利用放射自顯 影技術(shù)顯示標(biāo)記細(xì)胞，通過統(tǒng)計(jì)標(biāo)記有絲分裂細(xì)胞百 分?jǐn)?shù)的辦法來測定細(xì)胞周期

。放射標(biāo)記物為

3

H或者

14

C標(biāo)記的TdR。98ppt課件99ppt課件T

G2

+1/2T

M

T

G2

100

50

0

T

M

T

s

T

c

常以T

C

-（T

G2

+T

M

+T

S

）的方式求出T

G1100ppt課件101ppt課件6.

MTT法測定細(xì)胞活力三、培養(yǎng)細(xì)胞的檢測指標(biāo)試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)，

四唑鹽比色法的原理：活細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能將

四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物甲臜（formazan)

，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物

，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標(biāo)儀測定

OD值。MTT法簡單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒性102ppt課件操作步驟：（1）細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板；10

3

-10

4

細(xì)胞/孔，每孔培養(yǎng)基總量200微升（96孔培養(yǎng)板每孔容積370微升），37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間（根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時(shí)間）（2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／

孔）；繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。（3）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO

液（150微升／孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解。（4）酶標(biāo)儀檢測各孔OD值（檢測波長570

納米）。記錄結(jié)果，繪制細(xì)胞生長曲線。每隔24小時(shí)測量一個(gè)點(diǎn)，3個(gè)平行樣品！103ppt課件視頻：藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響——細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)案例

.wmv

RNAi基因抑制對(duì)細(xì)胞生長和增殖的影響

.ppt

基因抑制對(duì)細(xì)胞生長和增殖的影響.ppt104ppt課件

離體活細(xì)胞染 色觀察中性紅染色中性紅是常用的活體染色染料，常用的濃度為1:10000，用生理鹽水(或Hanks液)溶解后進(jìn)行高壓蒸氣滅菌暗處存放，可直接浸染活體細(xì)胞顯微鏡下觀察或用于細(xì)胞的病毒蝕斑，肉眼計(jì)數(shù)空斑數(shù)目。因其毒性大，染色后細(xì)胞不能再培養(yǎng)。105ppt課件臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞死活鑒定——

染料排除檢測法

用0.5%濃度的臺(tái)盼藍(lán)（Trypan

blue

）,用PBS配制，室溫保存，該染料只對(duì)死細(xì)胞著色，可測定活細(xì)胞數(shù)和計(jì)算存活百分率。

106ppt課件熒光染料染色觀察

溴化乙錠（EB）和碘化丙啶（PI）染色嵌入核酸雙鏈之間，只能標(biāo)記死細(xì)胞?。t色熒光）Acridine

Orange（AO

）丫啶橙可染活或死細(xì)胞，同時(shí)標(biāo)記

DNA和RNADNA：綠色熒光

RNA：紅色熒光107ppt課件Chapter

3

細(xì)胞工程基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)◆實(shí)驗(yàn)室設(shè)施與基本條件◆無菌技術(shù)◆顯微技術(shù)◆細(xì)胞觀察與分析◆細(xì)胞分離◆細(xì)胞保存與復(fù)蘇108ppt課件1、動(dòng)物細(xì)胞的解離常用機(jī)械法和消化法進(jìn)行當(dāng)實(shí)驗(yàn)室需要制備具有均勻細(xì)胞層的培養(yǎng)物；從單個(gè)細(xì)胞出發(fā)獲得細(xì)胞群體；從一定量的組織中獲得最多的細(xì)胞量時(shí)。109ppt課件機(jī)械法解離細(xì)胞胞懸液的分離。右的小塊。1）離心分離法：適用于血液、腹水等細(xì)2）切割分離法：將組織塊剪切成成1mm3左3）機(jī)械分散法：纖維成分很少的某些軟組織（脾、胸腺、腦等）。110ppt課件消化法解離細(xì)胞是破損細(xì)胞。3）螯合劑解離細(xì)胞法：分離效果差1）胰蛋白酶解離細(xì)胞法：所需時(shí)間較短，主要缺點(diǎn)2）膠原酶解離細(xì)胞法：這種方法對(duì)解離胚胎性、正常和惡性組織是很有效的。膠原酶最終濃度度200u/ml，36.5℃溫育，一般溫育4-48h。膠原酶和透明質(zhì)酸酶協(xié)同作用有助于分離大鼠或兔的肝臟組織。（通常用1：1的EDTA和胰蛋白酶混合液）111ppt課件112ppt課件2、植物細(xì)胞的分離葉片是分離單細(xì)胞的最好材料機(jī)械法酶解法113ppt課件2-1、機(jī)械法

&Ball

(1968)

第一種方法：用刀片刮葉片

研究材料：花生成熟葉片

研究者和時(shí)間：Ball&Joshi

(1965)

、

Noggle

(1967)

、Joshi

114ppt課件具體方法撕去下表皮露出葉肉細(xì)胞用解剖刀刮下細(xì)胞115ppt課件第二種方法：葉片研碎、離心加研磨介質(zhì)

研碎成粉過濾、離心116ppt課件2-2、酶解法

Takebe等（1968）最早報(bào)道：用果膠酶處理可以分離大量的葉肉細(xì)胞加果膠酶過濾、離心117ppt課件3、單個(gè)細(xì)胞的獲得（1）有限稀釋法118ppt課件（1）流式細(xì)胞術(shù)（flow

cytometry

，F(xiàn)CM）

Fluorescence

activated

cell

sorter,

FACS

?

用途：對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行快速定量分析與分選

的一門技術(shù)。?

原理：包在鞘液中的細(xì)胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成 包含單個(gè)細(xì)胞的液滴，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出 散射光和熒光，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，送入計(jì)算 機(jī)處理，輸出統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度 的細(xì)胞亞群，分離純度可達(dá)99%。包被細(xì)胞的液流稱為鞘 液，所用儀器稱為流式細(xì)胞計(jì)

（flowcytometer）。119ppt課件120ppt課件121ppt課件122ppt課件（3）顯微操作/注射儀123ppt課件（4）激光捕獲顯微分離系統(tǒng)

Laser

Capture

Microdissection

System

（LCM）可以準(zhǔn)確、快速、無損傷地分離出純凈的特定細(xì)胞或組織，保證了實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞內(nèi)生物分子的完整性

，以便用于后續(xù)的DNA、RNA和蛋白質(zhì)分析。124ppt課件（5）免疫磁珠分離（immunomagnetic

beads

separation

）免疫磁珠法分離細(xì)胞是基于細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，在外加磁場中，通過抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場中，無該種表面抗原的細(xì)胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結(jié)合而沒有磁性，不在磁場中停留，從而使細(xì)胞得以分離。

125ppt課件Chapter

3

細(xì)胞工程基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)◆實(shí)驗(yàn)室設(shè)施與基本條件◆無菌技術(shù)