色譜定量方法講稿

色譜定量方法講稿第1頁(yè)，課件共34頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月內(nèi)容定量分析基礎(chǔ)定量方法影響定量分析結(jié)果準(zhǔn)確性的因素色譜定量分析結(jié)果數(shù)據(jù)處理第2頁(yè)，課件共34頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月定量分析基礎(chǔ)定量分析定義定量分析就是要確定樣品中某一組分的準(zhǔn)確含量。色譜定量分析是一種相對(duì)定量方法，是根據(jù)檢測(cè)器的響應(yīng)值與被測(cè)組分的量，在某些條件限定下成正比的關(guān)系來(lái)進(jìn)行定量分析的。第3頁(yè)，課件共34頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月色譜定量分析的基本公式Wi（ci）=fiAi（hi）Wi——組分的質(zhì)量；ci——組分的濃度；fi——組分的校正因子；Ai——組分的峰面積；hi——組分的峰高。想得到可靠的定量分析結(jié)果，需要準(zhǔn)確測(cè)定fi、Ai或hi第4頁(yè)，課件共34頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月峰面積和峰高峰面積——色譜峰與峰底（或基線(xiàn)）所圍成的面積；峰高——色譜峰峰尖至峰底（或基線(xiàn)）的距離；峰底——從峰的起點(diǎn)與峰的終點(diǎn)之間的一條連接直線(xiàn)；基線(xiàn)——在正常操作條件下，僅有流動(dòng)相通過(guò)檢測(cè)器時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)曲線(xiàn)；一個(gè)完全分離的峰，峰底和基線(xiàn)是重合的。第5頁(yè)，課件共34頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月峰面積和峰高的測(cè)定使用積分儀和色譜工作站測(cè)量峰面積和峰高

儀器根據(jù)設(shè)定的積分參數(shù)（半峰寬、斜率、最小峰面積或峰高等）和基線(xiàn)的設(shè)定來(lái)計(jì)算每個(gè)色譜峰的峰面積和峰高使用記錄儀記錄色譜峰

需要手工測(cè)量的方法計(jì)算色譜峰的峰面積和峰高第6頁(yè)，課件共34頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月定量校正因子的測(cè)定絕對(duì)校正因子

前述公式中，fi為i組分的校正因子，其物理意義是單位峰面積（峰高）所代表的i組分的量，是一個(gè)與i組分的物理化學(xué)性質(zhì)和檢測(cè)器性質(zhì)有關(guān)的常數(shù)；

對(duì)同一個(gè)檢測(cè)器，等量的不同物質(zhì)其響應(yīng)值是不同的，但對(duì)于同一種物質(zhì)其響應(yīng)值只與該物質(zhì)的量（或濃度）有關(guān)。第7頁(yè)，課件共34頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月絕對(duì)校正因子計(jì)算公式

fi=mi(ci)/Ai(hi)mi(ci)——i組分的質(zhì)量（濃度）；Ai(hi)——i組分的峰面積（峰高）。由上式計(jì)算出的校正因子稱(chēng)為絕對(duì)校正因子，它只適用于這一個(gè)檢測(cè)器。第8頁(yè)，課件共34頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月相對(duì)校正因子相對(duì)校正因子(f)是某物質(zhì)(i)與基準(zhǔn)物質(zhì)(s)的絕對(duì)校正因子之比。計(jì)算公式

f=fi/fs=mi(ci)×As(hs)/[ms(cs)×Ai(hi)]常用的基準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)不同檢測(cè)器是不同的

熱導(dǎo)檢測(cè)器——苯

氫火焰離子化檢測(cè)器——正庚烷第9頁(yè)，課件共34頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月定量方法色譜中常用的定量方法

歸一化法

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法

內(nèi)標(biāo)法

標(biāo)準(zhǔn)加入法按測(cè)量參數(shù)分為峰面積法和峰高法

第10頁(yè)，課件共34頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月峰面積法和峰高法的選擇如何選用主要決定于在檢測(cè)器的線(xiàn)性范圍內(nèi)，峰高和峰面積測(cè)量的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。在分離度較好，色譜峰形較好，峰面積可以準(zhǔn)確測(cè)量時(shí)，特別是氣相程序升溫和液相梯度洗脫時(shí)，適宜用峰面積法定量；反之，如分離不好、峰形不佳時(shí)，用峰高法定量較好。保留時(shí)間短峰形較尖的色譜峰，峰高法比峰面積法更準(zhǔn)確；保留時(shí)間長(zhǎng)峰形較寬的色譜峰，峰面積法比峰高法更準(zhǔn)確。第11頁(yè)，課件共34頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月歸一化法定義——把所有出峰的組分含量之和按100%計(jì)的定量方法。當(dāng)樣品中的所有組分均能流出色譜柱，并在檢測(cè)器上都能產(chǎn)生信號(hào)的樣品，可用歸一化法定量。計(jì)算公式第12頁(yè)，課件共34頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月歸一化法優(yōu)點(diǎn)

簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，特別是進(jìn)樣量不容易準(zhǔn)確控制時(shí)，進(jìn)樣量的變化對(duì)定量結(jié)果的影響很小。其它操作條件，如流速、柱溫等變化對(duì)定量結(jié)果的影響也很小。缺點(diǎn)

校正因子的測(cè)定較為麻煩主要用于GC的定量測(cè)定。第13頁(yè)，課件共34頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法也稱(chēng)為外標(biāo)法，是色譜定量分析中比較常用的方法。具體做法：

1、配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列，在規(guī)定的色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)量色譜峰的峰面積或峰高，用峰面積或峰高對(duì)樣品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)；

2、在與繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)完全相同的色譜條件下進(jìn)行樣品的測(cè)定，測(cè)量色譜峰的峰面積或峰高，然后根據(jù)峰面積或峰高在工作曲線(xiàn)上查出樣品組分的濃度；

3、根據(jù)樣品處理?xiàng)l件，計(jì)算原樣品中組分的含量。第14頁(yè)，課件共34頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法單點(diǎn)校正法——當(dāng)待測(cè)組分含量變化不大，且已知這一組分的大概含量時(shí)，也可不必繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)，而是選取和待測(cè)組分會(huì)含量相近的已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，與待測(cè)樣品溶液在相同色譜條件下分別進(jìn)樣，測(cè)量待測(cè)組分和標(biāo)準(zhǔn)樣品的峰面積或峰高，由下式計(jì)算樣品溶液中待測(cè)組分的含量。單點(diǎn)校正法實(shí)際上是利用原點(diǎn)作為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上的另一點(diǎn)。因此，當(dāng)方法存在系統(tǒng)誤差（標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)不通過(guò)原點(diǎn)），單點(diǎn)校正法的誤差較大。第15頁(yè)，課件共34頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法優(yōu)點(diǎn)

繪制好標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)后測(cè)定工作就很簡(jiǎn)單了，適合大量樣品的分析。缺點(diǎn)

1、每次樣品分析的色譜條件很難完全相同，容易出現(xiàn)誤差；

2、繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)一般使用待測(cè)組分的標(biāo)準(zhǔn)樣品，對(duì)樣品前處理過(guò)程中待測(cè)組分的變化無(wú)法進(jìn)行補(bǔ)償。第16頁(yè)，課件共34頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法——選擇適宜的物質(zhì)作為欲測(cè)組分的參比物，定量加到樣品中去，依據(jù)欲測(cè)組分和參比物在檢測(cè)器上的響應(yīng)值（峰面積或峰高）之比和參比物加入的量進(jìn)行定量分析的方法。內(nèi)標(biāo)法與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法相比，有利于消除色譜條件不完全重現(xiàn)、進(jìn)樣量不準(zhǔn)確等所帶來(lái)的誤差。第17頁(yè)，課件共34頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法的關(guān)鍵是選擇合適的內(nèi)標(biāo)物。內(nèi)標(biāo)物的選擇條件：

1、內(nèi)標(biāo)物應(yīng)是原樣品中不存在的純物質(zhì)，該物質(zhì)的性質(zhì)應(yīng)盡可能與待測(cè)組分相近，不與被測(cè)樣品起化學(xué)反應(yīng)，同時(shí)要能完全溶于被測(cè)樣品中；

2、內(nèi)標(biāo)物的峰應(yīng)盡可能接近待測(cè)組分的峰，或位于幾個(gè)待測(cè)組分的峰中間，但必須與樣品中所有峰不重疊，完全分開(kāi)；

3、內(nèi)標(biāo)物的加入量應(yīng)與待測(cè)組分相近。第18頁(yè)，課件共34頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法——為使內(nèi)標(biāo)法適用于大量樣品分析，可將內(nèi)標(biāo)法與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法結(jié)合。具體做法

1、配制待測(cè)組分的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入同樣量的內(nèi)標(biāo)物；

2、在相同色譜條件下分別測(cè)定加入內(nèi)標(biāo)的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；

3、以待測(cè)組分與內(nèi)標(biāo)物的響應(yīng)值之比為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)作圖，繪制內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)；

4、分析樣品時(shí)，取和繪制內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)相同體積的樣品和相同量的內(nèi)標(biāo)物，在相同的色譜條件下測(cè)定；

5、得到樣品溶液中待測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的響應(yīng)值之比，由此值在內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)上查出樣品中待測(cè)組分的濃度，進(jìn)而算出待測(cè)組分在樣品中的含量。第19頁(yè)，課件共34頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月內(nèi)標(biāo)法優(yōu)點(diǎn)

進(jìn)樣量變化、色譜條件的微小變化對(duì)內(nèi)標(biāo)法定量結(jié)果影響不大；在樣品前處理前加入內(nèi)標(biāo)物，再進(jìn)行樣品前處理，可不分補(bǔ)償待測(cè)組分在樣品前處理時(shí)的損失。缺點(diǎn)

選擇適當(dāng)?shù)膬?nèi)標(biāo)物很困難；使用內(nèi)標(biāo)物的操作比較麻煩。內(nèi)標(biāo)法定量比標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法定量的準(zhǔn)確度和精密度都要好。第20頁(yè)，課件共34頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月標(biāo)準(zhǔn)加入法標(biāo)準(zhǔn)加入法——實(shí)際上是一種特殊的內(nèi)標(biāo)法，是在選擇不到合適的內(nèi)標(biāo)物時(shí)，以待測(cè)組分的純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物，加入到待測(cè)樣品中，然后在相同的色譜條件下，測(cè)定加入待測(cè)組分純物質(zhì)前后待測(cè)組分的峰面積（或峰高），從而計(jì)算待測(cè)組分在樣品中的含量。第21頁(yè)，課件共34頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月標(biāo)準(zhǔn)加入法優(yōu)點(diǎn)

1、不需要另外的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作內(nèi)標(biāo)物；

2、如在樣品前處理前就加入已知準(zhǔn)確量的待測(cè)組分，則可完全補(bǔ)償待測(cè)組分在前處理過(guò)程中的損失。缺點(diǎn)

要求兩次測(cè)定的色譜條件、進(jìn)樣量完全相同。第22頁(yè)，課件共34頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月影響定量分析結(jié)果準(zhǔn)確性的因素樣品制備

1、干擾物質(zhì)盡可能的分離出去；

2、樣品中的待測(cè)組分能否盡可能多的轉(zhuǎn)入制備好的樣品溶液中；

3、樣品制備和儲(chǔ)存過(guò)程中防止損失和被玷污

4、采用衍生化技術(shù)時(shí)，反應(yīng)一定是定量的。第23頁(yè)，課件共34頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月影響定量分析結(jié)果準(zhǔn)確性的因素進(jìn)樣技術(shù)

1、采用歸一化法、內(nèi)標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)加入法時(shí)，進(jìn)樣的誤差可以被這些方法的本身的特性所消除；

2、進(jìn)樣對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法定量分析的影響主要有以下兩個(gè)因素：

a.進(jìn)樣裝置的準(zhǔn)確性和精度

b.分析人員對(duì)進(jìn)樣技術(shù)掌握的熟練程度第24頁(yè)，課件共34頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月影響定量分析結(jié)果準(zhǔn)確性的因素色譜條件的選擇

1、在分離度良好的條件下，柱效的變化對(duì)峰面積定量沒(méi)有影響，對(duì)峰高定量會(huì)產(chǎn)生影響；

2、流動(dòng)相流速變化對(duì)歸一化法、內(nèi)標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)加入法定量結(jié)果無(wú)影響，但對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法的定量結(jié)果有影響，而且其對(duì)峰面積定量結(jié)果的影響比對(duì)峰高影響大，因此，在流動(dòng)相流速不易控制時(shí)，如采用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法定量，宜采用峰高法定量；

3、氣相色譜中，柱溫會(huì)影響保留時(shí)間和峰高，且其對(duì)峰高的影響隨分子量的增加而增大。但柱溫對(duì)峰面積大小影響較小，所以在氣相色譜中多采用峰面積定量。第25頁(yè)，課件共34頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月影響定量分析結(jié)果準(zhǔn)確性的因素檢測(cè)器特性

檢測(cè)器工作的穩(wěn)定性和線(xiàn)性范圍將直接影響色譜定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

1、進(jìn)樣量不能使待測(cè)組分的響應(yīng)值超出檢測(cè)器的線(xiàn)性范圍，選用的進(jìn)樣量最好能使檢測(cè)器的響應(yīng)值落到其線(xiàn)性范圍的中間部分，此時(shí)誤差最?。?/p>

2、選擇適當(dāng)?shù)臋z測(cè)器和檢測(cè)器的工作參數(shù)，使定量分析結(jié)果由檢測(cè)器引起的誤差降到最低。第26頁(yè)，課件共34頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月色譜定量分析結(jié)果數(shù)據(jù)處理誤差和準(zhǔn)確度

誤差（絕對(duì)誤差和相對(duì)誤差）是用來(lái)表示定量分析結(jié)果準(zhǔn)確度的量度，即定量分析結(jié)果與真值的符合程度。評(píng)價(jià)定量分析結(jié)果準(zhǔn)確度的常用方法

1、利用標(biāo)準(zhǔn)樣品（標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）來(lái)評(píng)價(jià)定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確度；

2、利用測(cè)定回收率的方法來(lái)評(píng)價(jià)定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確度。第27頁(yè)，課件共34頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月色譜定量分析結(jié)果數(shù)據(jù)處理偏差和精密度

偏差是用來(lái)評(píng)價(jià)定量分析結(jié)果精密度的量度，是對(duì)同一樣品的多次測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性和再現(xiàn)性的評(píng)價(jià)。

偏差的表示方法很多，包括平均偏差、相對(duì)偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差等。目前較多使用的是標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，因?yàn)樗鼘?duì)一組分析測(cè)定中的極值反應(yīng)比較靈敏，能更好的表征多次測(cè)定結(jié)果的精密度。第28頁(yè)，課件共34頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月色譜定量分析結(jié)果數(shù)據(jù)處理準(zhǔn)確度和精密度的關(guān)系

理想的定量分析結(jié)果應(yīng)該是準(zhǔn)確度和精密度都好的分析結(jié)果。

定量分析結(jié)果的精密度高，偏差小，只能說(shuō)明實(shí)驗(yàn)中的隨機(jī)誤差小；系統(tǒng)誤差的大小只能通過(guò)準(zhǔn)確度來(lái)衡量，準(zhǔn)確度不好則是由于實(shí)驗(yàn)中存在較大的系統(tǒng)誤差。第29頁(yè)，課件共34頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月色譜定量分析結(jié)果數(shù)據(jù)處理標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)的繪制——線(xiàn)性回歸在色譜定量分析中檢測(cè)器的響應(yīng)值與待測(cè)組分濃度應(yīng)呈線(xiàn)性關(guān)系，如無(wú)誤差存在，所有的點(diǎn)都應(yīng)在一條直線(xiàn)上；實(shí)際上，由于隨機(jī)誤差不可避免，特別是誤差較大，實(shí)驗(yàn)點(diǎn)較多時(shí)，要得到一條使所有實(shí)驗(yàn)點(diǎn)誤差都最小的直線(xiàn)（最佳回歸線(xiàn)），采用的方法是對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，求出回歸方程，再配線(xiàn)作圖。當(dāng)自變量為一個(gè)時(shí)稱(chēng)為一元回歸。色譜定量分析中繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)的過(guò)程就是一元線(xiàn)性回歸方程的求解和配線(xiàn)過(guò)程。

第30頁(yè)，課件共34頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月色譜定量分析結(jié)果數(shù)據(jù)處理線(xiàn)性回歸方程y=ax+bb稱(chēng)回歸系數(shù)，是標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)的斜率；a是常數(shù)項(xiàng)，是回歸直線(xiàn)的截距，此項(xiàng)應(yīng)很小接近零，a值過(guò)大說(shuō)明實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有系統(tǒng)誤差。回歸直線(xiàn)就是在所有直線(xiàn)中使差方和（各數(shù)據(jù)點(diǎn)的誤差的平方的加和）最小的那條直線(xiàn)，即回歸直線(xiàn)的系數(shù)b和常數(shù)項(xiàng)a應(yīng)使差方和達(dá)到極小值。此求回歸直線(xiàn)的方法通常被稱(chēng)為最小二乘法。第31頁(yè)，課件共34頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月色譜定量分析結(jié)果數(shù)據(jù)處理相關(guān)系數(shù)——用來(lái)表示線(xiàn)性關(guān)系的好壞程度相關(guān)系數(shù)越接近1，說(shuō)明線(xiàn)性關(guān)系越好色譜定量分析繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)時(shí)需要計(jì)算相關(guān)系數(shù)，只有當(dāng)相關(guān)系數(shù)大于某個(gè)限定值，才能說(shuō)明配出的回歸直線(xiàn)是有意義的。

繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)時(shí)一般選取3-6個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，相關(guān)系數(shù)起碼應(yīng)在0.95以上。如達(dá)不到要求，可能存在以下原因：

1、所選濃度范圍使檢測(cè)器的響應(yīng)值超出了該檢測(cè)器響應(yīng)值的線(xiàn)性范圍；

2、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的精密度太差，過(guò)于分散。