微生物細胞工程課件

第十三章微生物細胞工程第十三章微生物細胞工程1微生物細胞的特點微生物作為可以獨立存在的個體，其生長特點、代謝的特點與植物、動物有著顯著的區(qū)別。一般情況下，微生物由其自身完成其基本功能；微生物細胞的特點微生物作為可以獨立存在的個體，其生長特點、代2微生物菌種選育的目的和意義微生物菌種選育的目的和意義3微生物細胞的改造－育種傳統(tǒng)菌種選育技術(shù)雜交和原生質(zhì)體融合技術(shù)基因工程定向進化微生物細胞的改造－育種傳統(tǒng)菌種選育技術(shù)4傳統(tǒng)菌種選育技術(shù)自發(fā)突變育種誘變育種傳統(tǒng)菌種選育技術(shù)自發(fā)突變育種5微生物突變類型變異類型變異性狀形態(tài)變異菌落形態(tài)菌落大小、形態(tài)、表面結(jié)構(gòu)、顏色、產(chǎn)孢子多寡或有無細胞形態(tài)鞭毛、夾膜、菌絲形狀、生長速度、分枝多少及形狀、孢子大小和形狀、產(chǎn)孢子器官形狀細胞結(jié)構(gòu)細胞膜、孢子的表面結(jié)構(gòu)及抗原構(gòu)造生理生化變異糖類分解能力、色素產(chǎn)生能力、有關(guān)酶的活性、營養(yǎng)要求和性質(zhì)、溫度敏感性、代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力抗性變異耐藥性、對自身代謝產(chǎn)物抗性、噬菌體抗性、對紫外線及其他輻射因子的抗性等病原性變異病原產(chǎn)生能力、表面抗原等微生物突變類型變異類型變異性6遺傳變異類型遺傳變異類型細胞核細胞質(zhì)質(zhì)粒、噬菌體和線粒體DNA體外重組轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染進入宿主細胞中DNA染色體數(shù)目（單、雙、多倍體和非整倍體）突變重組（轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導、接合和融合）點突變（DNA分子中某一個堿基發(fā)生順序或數(shù)目的變化所致）區(qū)段突變（染色體或DNA片段的缺失、易位、倒位、替換、添加等造成的突變）遺傳變異類型遺傳變異類型細胞核細胞質(zhì)質(zhì)粒、噬菌體和線粒體DN7自發(fā)突變育種從生產(chǎn)中育種定向培育優(yōu)良菌株卡介苗的獲得吡哆醇高產(chǎn)菌株的獲得自發(fā)突變育種從生產(chǎn)中育種卡介苗的獲得吡哆醇高產(chǎn)菌株的獲得8誘變育種誘變育種的基本環(huán)節(jié)誘變育種誘變育種的基本環(huán)節(jié)9谷氨酸棒桿菌的野生型（左）和dapD突變株（右）細胞的電鏡照片谷氨酸棒桿菌的野生型（左）和dapD突變株（右）細胞的電鏡照10誘變育種中的幾個原則挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株單一遺傳純菌株選用對誘變劑敏感的菌株選用有應用前景的菌株來自生產(chǎn)中的自發(fā)突變菌株選擇簡單有效的誘變劑及合適劑量處理單細胞或單孢子懸液復合誘變劑的處理誘變育種中的幾個原則挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株11營養(yǎng)缺陷型的篩選方法1、誘變處理2、淘汰野生型抗生素法青霉素制霉菌素(抑制甾醇的合成)菌絲過濾法(適于真菌和放線菌)3、檢出缺陷型4、鑒定缺陷型營養(yǎng)缺陷型的篩選方法1、誘變處理12檢出缺陷型基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基(含菌)基本培養(yǎng)基完全或補充培養(yǎng)基夾層培養(yǎng)法檢出缺陷型基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基(含菌)基本培養(yǎng)基完全或補充培13限量補充法<1%蛋白胨大，野小，變檢出缺陷型限量補充法<1%蛋白胨大，野小，變檢出缺陷型14逐個檢出法完全培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基檢出缺陷型逐個檢出法完全培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基檢出缺陷型15培養(yǎng)完全培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基影印培養(yǎng)法檢出缺陷型培養(yǎng)完全培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基影印培養(yǎng)法檢出缺陷型16鑒定缺陷型含菌基本培養(yǎng)基含營養(yǎng)物濾紙片生長譜法(氨基酸、維生素、堿基等)鑒定缺陷型含菌基本培養(yǎng)基含營養(yǎng)物濾紙片生長譜法(氨基酸、維生17各種化學誘變劑常用濃度和處理時間誘變劑濃度處理時間（min）緩沖液終止反應方法效

應備

注亞硝酸（液體）0.01~0.1M5~10pH4.5,1M醋酸緩沖液pH8.6,0.07MNa2HPO4溶液脫去堿基中的氨基后引起堿基轉(zhuǎn)換，造成突變有致癌作用，小心操作硫酸二乙酯（液體）o.5~1%(V/V)孢子15~30，菌絲18~24hpH7.0磷酸緩沖液Na2S2O3或大量稀釋誘變作用較強，殺菌作用較弱，使DNA的堿基和磷酸基發(fā)生烷化作用，引起突變。不溶于水，加微量乙醇可溶解亞硝基胍（固體）0.1~1.0mg/ml，孢子3mg/ml(高濃度及堿性pH)孢子30~120,菌絲90~120pH6.0,1M磷酸或醋酸緩沖液或三羥基甲基氨基甲烷-縮蘋果酸緩沖液大量稀釋pH低于5~5.5時，同硫酸二乙酯形成亞硝酸，堿性條件下產(chǎn)生重氮甲烷，引起殺菌和變異有致癌作用，小心操作，避光保存，易產(chǎn)生突變?nèi)焊鞣N化學誘變劑常用濃度和處理時間誘變劑濃度處理時間（min18誘變劑使用續(xù)1氮芥（液狀物）0.1~1mg/ml密閉反應5~10甘氨酸或大量稀釋烷化劑，引起染色體畸變與NaHCO3作用即釋放N–芥子氣糜爛性毒氣，小心操作乙烯亞胺（液體）1:100~1:100028℃或低溫處理30~60稀釋烷化劑，高濃度效果較好有劇毒，易燃，可在4℃冰箱小心操作，避光保存鹽酸羥胺（液體）0.1~5%數(shù)小時或生長過程中誘變稀釋與胞嘧啶作用產(chǎn)生轉(zhuǎn)換，引起CG→AT突變有損健康，注意安全操作氯化鋰（白色粉末）0.3~0.5%加入培養(yǎng)基中，在生長過程中誘變稀釋需與紫外線、亞硝酸、硫酸二乙酯等復合處理才有效易溶于水，易潮解5-溴鳥嘧啶（白色粉末）20~30mg/ml與孢子懸浮液混合振蕩培養(yǎng)，處理一定時間后，稀釋涂皿稀釋有機體缺乏胸腺嘧啶時較易摻入DNA中引起突變，能誘發(fā)正突變與回復突變堿基類似物誘變劑使用續(xù)1氮芥（液狀物）0.1~1mg/ml密閉反應5~19微生物原生質(zhì)體融合方法微生物放線菌（鏈霉菌）G+細菌（桿菌）霉菌（頂頭孢霉）菌體準備液體培養(yǎng)基中加0.3%~1%甘氨酸液體培養(yǎng)基加0.5mol/L蔗糖0.2g濕菌體在含有0.01mol/LDTT的檸檬酸－磷酸鹽buffer中預處理60min穩(wěn)定劑Pbuffer※SMMADbuffer※※0.7mol/LNaCl酶及濃度溶菌酶1mg/ml，30℃，15~60min溶菌酶100mg/ml，42℃，30分鐘5mg/mlNovozyme、0.5%蝸牛酶＋1%纖維素酶，28℃，180min融合劑65%PEG（分子量4000）0.5~1min40%PEG（分子量6000）2min30%PEG（分子量6000），0.01mol/LCaCl2溶液＋0.05mol/L甘氨酸（pH=7.5）30℃，10min微生物原生質(zhì)體融合方法微生物放線菌G+細菌霉菌菌體準備液體培20

原生質(zhì)體融合-原生質(zhì)體融合-21原生質(zhì)體制備：（1）

根據(jù)材料選擇破壁酶

細菌：溶菌酶

真菌:Zymolyase-20T，5000T，Novozyme234，蝸牛酶，纖維素酶，

溶壁酶，崩潰酶，

幾丁質(zhì)酶等（2）

緩沖液（3）酶解條件

溫度、時間、酶成分配比等原生質(zhì)體制備：（1）根據(jù)材料選擇破壁酶22融合電融合技術(shù)：

原生質(zhì)體在電場中，由于加直流脈沖，膜被擊穿，導致融合的發(fā)生。特點：

空間定向，時間同步，顯微鏡監(jiān)視化學因子誘導融合：

聚乙二醇（polyetheneglycol,PEG）Ca2+

、Mg2+

等陽離子pH融合電融合技術(shù)：23再生

恢復細胞原貌，能夠再生長

高滲培養(yǎng)基

蔗糖

（0.6M）

山梨醇(1.0M)

氯化鈉(0.7M)再生恢復細胞原貌，能夠再生長24基因工程一、概念

基因工程是指在基因水平上的遺傳工程，即用人工方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質(zhì)－DNA大分子提取出來，在離體條件下進行切割后，把它和載體的DNA分子連接起來，然后導入某一受體細胞中，以讓外來的遺傳物質(zhì)在其中“安家落戶”，進行正常的復制和表達，從而獲得新物種的一種嶄新的育種技術(shù)。所以基因工種是人們在分子生物學理論指導下的一種自覺的能象工程一樣可事先設(shè)計和控制的育種新技術(shù)，是人工的離體的分子水平上的一種遺傳重組技術(shù)，是一種可完全超遠緣雜交的育種新技術(shù)，因而是一種最新、最有前途的定向育種新技術(shù)?；蚬こ桃?、概念25二、主要操作過程

（一）基因分離

1、分別提取供體細胞（各種生物都可選用）的DNA與作為載體的松馳型細菌質(zhì)粒（也可用噬菌體或病毒作載體）。2、根據(jù)“工程藍圖”的要求，在供體DNA中加入專一性很強的限制性核酸內(nèi)切酶，從而獲得帶有特定基因并露出粘性末端的DNA單鏈部分（必須時可人工合成粘性末端）。二、主要操作過程（一）基因分離26（二）體外重組

把供體細胞DNA片段與質(zhì)粒DNA片段放在試管中，在較低的溫度（56℃）下混合“退火”。由于每一種限制性內(nèi)切酶所切斷的雙鏈DNA片段的粘接末端有相同的核苷酸組成，所以當兩者混在一起時，凡粘接末端上堿基互補片段就會因氫鍵的作用而彼此吸引，重新形成雙鏈，這時在外加的連接酶作用下，供體的DNA與質(zhì)粒DNA片段相連，形成了一個完整復制能力的環(huán)狀重組體“雜種質(zhì)粒”。

（二）體外重組把供體細胞DNA片段與質(zhì)粒D27（三）重組載體導入受體細胞內(nèi)（四）復制、表達

這種雜種質(zhì)粒進入受體細胞后，通過自我復制而擴增，并使受體細胞表達為供體細胞所固有的部分遺傳性狀，這種受體菌，即成為“工程菌”。

（三）重組載體導入受體細胞內(nèi)（四）復制、表達28（五）篩選、繁殖

質(zhì)粒，或所帶DNA能表達產(chǎn)生一定產(chǎn)物，可通過一選擇性培養(yǎng)基或試劑鑒別出來。

原來100000g胰臟僅能提取3－4g胰島素，而用工程菌發(fā)酵生產(chǎn)，只要幾升發(fā)酵液便可取得同樣數(shù)量的產(chǎn)品。（五）篩選、繁殖質(zhì)粒，或所帶DNA能表達產(chǎn)29分子育種容錯PCRDNAshuffling分子育種容錯PCR30容錯PCR（Error-pronePolymeraseChainReaction,ep-PCR）Taq聚合酶是從一株耐熱細菌Thermusaquaticus中分離獲得，由于它缺乏3’－5’的校正活性，因此在PCR過程中會插入一些錯誤的堿基。在通常情況下，發(fā)生錯誤堿基插入的頻率為0.1～2x10-4。通過改變PCR的一些反應條件，可以增加這種錯誤堿基插入的頻率，從而可用來實現(xiàn)基因的定向進化。容錯PCR（Error-pronePolymeraseC31在PCR系統(tǒng)中可用于增加堿基錯誤插入頻率的方法增加MgCl2濃度；加入一定濃度的MnCl2；在PCR中采