論文匯報(bào)-課件

急性腦梗死外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CD4+CD25+CD127low表達(dá)及其臨床意義安徽省立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科陳曉菲、許文華、任明山1234研究背景與目標(biāo)研究內(nèi)容與方法研究結(jié)果與意義研究創(chuàng)新與不足1研究的背景與目標(biāo)研究背景急性腦血管病發(fā)病率、死亡率和致殘率極高，是人類死亡的第二大疾病和成人致殘的主要原因之一。目前，對卒中病理生理的認(rèn)識雖取得一些進(jìn)步，但其確切的病理生理機(jī)制仍未完全闡明。臨床上除對少部分發(fā)病時(shí)間窗內(nèi)患者溶栓治療外，其它循證有效的治療方法仍十分有限。

最新研究表明：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎炎癥性腸病繼發(fā)性血管炎抗磷脂綜合征腦卒中實(shí)際上也正是一個(gè)復(fù)雜的全身炎癥性疾病或自身免疫過程有學(xué)者提出全身和局部的炎癥和免疫反應(yīng)也是導(dǎo)致卒中的重要原因，并可能參與了血管缺血性損傷的第一階段和第二階段的病理損傷過程，以及卒中的修復(fù)、恢復(fù)和整個(gè)結(jié)局。1研究的背景與目標(biāo)中風(fēng)的免疫炎癥反應(yīng)機(jī)制：圖1：外周炎癥反應(yīng)的復(fù)雜相互作用1研究的背景與目標(biāo)圖2：中風(fēng)前后炎癥反應(yīng)機(jī)制A.促進(jìn)中風(fēng)發(fā)展的炎性機(jī)制1研究的背景與目標(biāo)B.中風(fēng)后的急性炎癥反應(yīng)階段：調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在限制腦缺血損傷中的潛在作用1研究的背景與目標(biāo)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞：CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）首先由日本學(xué)者Sakaquchi于1995年報(bào)道，是指部分高表達(dá)IL-2受體的α鏈(CD25)分子的CD4+T細(xì)胞具有獨(dú)特免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群能夠通過免疫負(fù)性調(diào)節(jié)的方式來抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的效應(yīng)負(fù)向調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)，維持免疫耐受。1研究的背景與目標(biāo)圖3：Treg缺陷在人和動物中的作用1研究的背景與目標(biāo)圖4：Treg在體外環(huán)境中能夠調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)1研究的背景與目標(biāo)但由于Foxp3是一種細(xì)胞核內(nèi)成分，檢測時(shí)需要固定破膜，并不能用于分離人類Treg細(xì)胞以作功能性研究，因此限制了其在人類中的應(yīng)用。Foxp3是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性標(biāo)志物1研究的背景與目標(biāo)最近的研究表明，CD4+CD25+CD127lowT細(xì)胞是目前人類外周血中自然發(fā)生的Treg細(xì)胞最好的膜標(biāo)記物。圖：幾種不同標(biāo)志物表達(dá)Foxp3的百分比1研究的背景與目標(biāo)采用CD25++和CD127-這對標(biāo)志物進(jìn)行臨床研究將能夠更精確地描述急性缺血性腦卒中患者Treg細(xì)胞對炎性介導(dǎo)免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)功能。1研究的背景與目標(biāo)研究目標(biāo)1研究的背景與目標(biāo)探討調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在急性缺血性腦卒中不同階段的作用進(jìn)一步揭示急性缺血性腦卒中的免疫相關(guān)發(fā)病機(jī)制.探討潛在的中風(fēng)治療的免疫基礎(chǔ)

研究內(nèi)容

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測60例急性腦梗死患者和22例健康體檢者外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg、CD4+CD25++Treg細(xì)胞水平、CD4+T細(xì)胞水平分析調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在急性缺血性腦卒中不同階段的變化探討調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在急性缺血性腦卒中發(fā)生發(fā)展中的作用123研究內(nèi)容與方法2研究路線圖健康體檢者急性腦梗死患者排除不符合入組標(biāo)準(zhǔn)者對照組病例組24h-48h組3-7d組8-14d組血標(biāo)本CD4+CD25+CD127-TregCD4+T細(xì)胞CD4+CD25++Treg整理分析數(shù)據(jù)2研究內(nèi)容與方法研究方法(1)收集病例：腦卒中組：2013年1月1日至2013年5月30日本院神經(jīng)科住院的缺腦卒中患者共60例,其中男41例,女19例,年齡43～80歲，平均年齡(61.50±10.69)歲。其中發(fā)病24~48h組16例、3~7d組22例，8~14d組22例。研究內(nèi)容與方法2納入標(biāo)準(zhǔn)：診斷符合第四屆全國腦血管病會議修訂標(biāo)準(zhǔn),全部病例均經(jīng)頭部CT和(或)MRI證實(shí)。所有患者均為24h內(nèi)的初次發(fā)病患者。至少有一位主治及以上級別醫(yī)生對患者進(jìn)行臨床診斷?；颊咧橥狻Ｅ懦龢?biāo)準(zhǔn)：患者不同意；近期有感染性疾病者；合并有糖尿病者；合并有心肝腎疾病者；合并有自身免疫性疾病者；有顱內(nèi)其他病變者。2研究內(nèi)容與方法2研究內(nèi)容與方法健康對照組：同期正常健康體檢成人22例,均選自2013年3月至2013年5月在安徽省立醫(yī)院體檢中心體檢的成人,男15例,女7例。年齡44～80歲，平均年齡(59.63±9.81)歲。對照組入選及排除標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)前2周內(nèi)身體健康,無感染性疾病。均系無心、肝、腦、腎和免疫、感染性疾病及糖尿病的健康成年人,頭部MRI檢查無顱內(nèi)疾病。（2）標(biāo)本采集：受試者均于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽取肘靜脈血2~3ml,肝素抗凝,標(biāo)本在采集后2h內(nèi)測定。2研究內(nèi)容與方法（3）標(biāo)本處理取2支FCM試管，分別標(biāo)記為染色管和對照管，用微量移液器在各標(biāo)記試管中分別均加入100l抗凝血，染色管中加入CD25-PE、CD4-FITC各10μl及CD127-PE2.5μl，對照管加入CD4-PE和IgG1-FITC各10μl，血液和試劑確保加入管底,不要沾在試管壁上;震蕩器上充分混勻,使抗凝全血與熒光標(biāo)記的單克隆抗體充分接觸,室溫避光反應(yīng)15min；加入溶血劑2ml，充分震蕩混勻,室溫避光反應(yīng)10min，加入生理鹽水2ml，1500rpm離心5min棄上清,取500μl立即上流式細(xì)胞儀檢測；2研究內(nèi)容與方法

(4)流式細(xì)胞儀檢測：每次檢測前常規(guī)用熒光微球和同型陰性對照試劑對儀器進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)測和調(diào)控,并用標(biāo)準(zhǔn)方法對各熒光素之間的干擾進(jìn)行補(bǔ)償,排除相互干擾；檢測時(shí)先根據(jù)前向角和側(cè)向角散射光信號,對淋巴細(xì)胞群進(jìn)行設(shè)門,每次獲取設(shè)門內(nèi)細(xì)胞20000個(gè)以上并保存數(shù)據(jù)。用CellQuestPro系統(tǒng)軟件獲取和分析20000個(gè)細(xì)胞2研究內(nèi)容與方法(5)數(shù)據(jù)處理：采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。兩組樣本間正態(tài)分布采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析,多組樣本間采用OneWayANOVO的單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2研究內(nèi)容與方法研究結(jié)果3研究結(jié)果與意義比較結(jié)果顯示，與正常對照組相比，患者外周血CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞CD4+T細(xì)胞比例在起病后24~48h、3~7d時(shí)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；8~14d則逐漸恢復(fù)至正常水平，與正常對照組無明顯差異(P>0.05);圖5表明在急性腦梗塞后超早期，炎性免疫反應(yīng)以促炎反應(yīng)為主，促炎因子過度激活，效應(yīng)T細(xì)胞過度活化，使Treg相對性減少，抑制了Treg活化分化，正是由于Treg免疫抑制能力的下降，這些發(fā)揮免疫保護(hù)作用的Treg細(xì)胞數(shù)量和功能的抑制加重了炎性反應(yīng)所致的腦組織二次損傷。提示CD4+CD25+CD127lowT細(xì)胞對缺血性腦損傷具有保護(hù)作用，其功能下調(diào)導(dǎo)致了缺血性腦損傷進(jìn)一步加重。3研究結(jié)果與意義比較結(jié)果顯示，與正常對照組相比，患者外周血CD4+CD25++Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例在起病后24~48h、3~7d時(shí)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；8~14d則逐漸恢復(fù)至正常水平，與正常對照組無明顯異(P>0.05);圖3研究結(jié)果與意義結(jié)果顯示，與正常對照組相比，患者外周血CD4+T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞比例在起病后24~48h、3~7d、8~14d時(shí)均高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。圖研究結(jié)果與意義3以上結(jié)果顯示，與正常對照組相比，急性缺血性腦卒中患者的CD4+T細(xì)胞比例明顯增高?？赡苡捎谧渲泻髶p傷所導(dǎo)致的血腦屏障破壞，使得平時(shí)隱含的特殊的CNS抗原暴露于免疫系統(tǒng)并得以進(jìn)入體循環(huán)，從而可能造成自身免疫性損傷。與此同時(shí)，急性缺血性腦卒中患者外周血CD4+CD25+CD127lowT細(xì)胞和CD4+CD25highT細(xì)胞比例在發(fā)病24h48h及37d較正常對照組下降，表明在急性缺血性腦卒中急性期免疫炎性反應(yīng)被激活，CD4+T細(xì)胞可能以誘導(dǎo)分化成促炎細(xì)胞因子為主，而具有免疫抑制功能的Treg細(xì)胞數(shù)量和功能則受到抑制，從而加重了腦組織損傷。而患者外周血CD4+CD25+CD127lowT細(xì)胞和CD4+CD25highT細(xì)胞比例在發(fā)病8~14d逐漸恢復(fù)至正常水平，則可能在缺血性腦卒中恢復(fù)期，機(jī)體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的Treg細(xì)胞，從而抑制免疫炎性反應(yīng)的發(fā)生，促進(jìn)腦組織神經(jīng)元的修復(fù)。3研究結(jié)果與意義圖1各組外周血CD4+CD25+CD127lowT細(xì)胞表達(dá)

Fig.1TheexpressionofCD4+CD25+CD127lowTcellsindifferentgroups

A:對照組；B：24~48h組；C:3~7d組；D：8~14d組圖3研究結(jié)果與意義圖2各組外周血CD4+CD25highTreg表達(dá)

Fig.1TheexpressionofCD4+CD25highTcellsindifferentgroups

A:對照組；B：24~48h組；C:3~7d組；D：8~14d組3研究結(jié)果與意義結(jié)論3（1）急性缺血性腦卒中患者急性期存在免疫耐受缺陷，Treg細(xì)胞