凝膠色譜法課件

2003年4月14日宣布人類基因組序列圖完成這標志著進入了后基因組時代。人類基因組：指DNA分子所攜帶的全部遺傳信息。蛋白質(zhì)組：生物個體表達的蛋白質(zhì)分子的總和。主要是對蛋白質(zhì)功能的研究2003年4月14日宣布人類基因組序列圖完成人類基因組：指D專題5DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)專題5DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)蛋白質(zhì)分離的原理：

根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對其他分子的親和力等等，可以用來分離不同種類的蛋白質(zhì)。

一、基礎(chǔ)知識蛋白質(zhì)分離的原理：根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的（一）凝膠色譜法2.凝膠：

大多數(shù)凝膠是由多糖類化合物（如葡聚糖或瓊脂糖）構(gòu)成的多孔小球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道。

根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，來進行分離。1.概念：（分配色譜法）（一）凝膠色譜法2.凝膠：大多數(shù)凝膠是由多糖類化合3.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的具體過程3.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的具體過程凝膠色譜法課件4.凝膠色譜法的原理①相對分子量較小的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長，移動速度較慢;②相對分子量較大的蛋白質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。進行體外實驗時，如何保證蛋白質(zhì)不會發(fā)生變性呢？4.凝膠色譜法的原理①相對分子量較小的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部

（二）緩沖溶液

能夠抵制外界的酸和堿對溶液PH值的影響，維持PH基本不變。1.作用:2.緩沖溶液的配制:

通常由1－2種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PH范圍內(nèi)使用的緩沖液。3.在本課題中使用的緩沖液是:磷酸緩沖液,成分：磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉如何證明凝膠色譜法獲得的蛋白質(zhì)是目的蛋白？（二）緩沖溶液能夠抵制外界的酸和堿對

（三）電泳：1.概念：帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程。2.原理：

①許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團，在一定的PH下，這些基團會帶上正電或負電。②在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。③電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。（三）電泳：1.概念：帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷3.類型:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳。3.類型:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳。

聚丙烯酰胺凝膠電泳在測定蛋白質(zhì)分子量時常用十二烷基硫酸鈉（SDS）—聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺（形成交聯(lián)）丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚反應(yīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳在測定蛋白質(zhì)分子量時常

蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。

1.原理：

SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDS的作用下會解聚成單條肽鏈，因此測定的結(jié)果只是單條肽鏈的分子量。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物，SDS所帶負電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。2.SDS作用機理:蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決1.原理用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量的方法

使用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)的分子量時，可選用一組已知分子量的標準蛋白同時進行電泳，根據(jù)已知分子量的標準蛋白的電泳區(qū)帶位置，可以測定未知蛋白質(zhì)的分子量。市場上有高分子量、次高分子量及低分子量的標準蛋白試劑出售。用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量的方法凝膠色譜法課件

二、實驗操作樣品處理→粗分離→純化→純度鑒定蛋白質(zhì)提取和分離步驟血液血漿水分固體物質(zhì)：血漿蛋白、無機鹽、磷脂、葡萄糖等血細胞白細胞血小板紅細胞（最多）血紅蛋白（90％）兩個α－肽鏈兩個β一肽鏈四個亞鐵紅