可見紫外分光光度法

可見紫外分光光度法第1頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月主要內(nèi)容第一節(jié)物質(zhì)的吸收光譜第二節(jié)分光光度法基本原理第三節(jié)可見分光光度法

第四節(jié)提高測量靈敏度和準確度的方法第五節(jié)紫外分光光度法簡介第2頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月目的要求掌握分光光度法的基本原理——Lambert-Beer定律；吸光度及透光率、吸光系數(shù)、摩爾吸光系等概念、相互關(guān)系及計算。熟悉標準曲線法及標準對照法。了解吸收光譜的意義及繪制方法。了解分光光度計的基本構(gòu)造,提高測量靈敏度和準確度的方法。了解可見分光光度法和紫外分光光度法的異同點。

第3頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月分光光度法

根據(jù)物質(zhì)的吸收光譜及光的吸收定律，對物質(zhì)進行定性、λυ定量分析的一種方法。第4頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月預(yù)習問題與提綱1．在吸收光譜中，定性分析和定量分析的依據(jù)是什么？2．

Lambert–Beer定律的公式及應(yīng)用？3．可見分光光度法有哪兩種？

4．分光光度法的誤差有哪些？5．如何提高分析的準確度？

第5頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月主要內(nèi)容第一節(jié)物質(zhì)的吸收光譜*第二節(jié)分光光度法基本原理*第三節(jié)可見分光光度法*

第四節(jié)提高測量靈敏度和準確度的方法*第五節(jié)紫外分光光度法簡介*本章小結(jié)*參考文獻*第6頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)物質(zhì)的吸收光譜

一、物質(zhì)對光的選擇性吸收物質(zhì)對光的吸收具有選擇性，若溶液選擇性地吸收了某種顏色的光，則溶液呈吸收光的互補光。第7頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)物質(zhì)的吸收光譜二．物質(zhì)的吸收光譜（A-λ圖）以波長為橫坐標，吸光度A為縱坐標作圖，可得一曲線，即為吸收光譜(absorptionspectrum)或稱吸收曲線(absorptioncurve),右圖為不同濃度時三(鄰二氮菲)合鐵(II)配離子的吸收光譜。第8頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)物質(zhì)的吸收光譜特點:①具有最大吸收波長。②不同物質(zhì),λmax不同，λmax

是定性分析的依據(jù)。③λmax幾乎不隨物質(zhì)的濃度而變。第9頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)物質(zhì)的吸收光譜④λmax附近，A最大，并與濃度c

呈正比關(guān)系----定量分析依據(jù)。⑤遠離λmax的光,物質(zhì)幾乎不吸收光（A→0）,這些光的A與物質(zhì)的c無直接關(guān)系----不作定量分析依據(jù)。注意：物質(zhì)對光的吸收越多，呈顏色越深，溶液濃度越濃。第10頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

分光光度法

基本原理

一、透光率和吸光度入射光I0

吸收Ia

透射It

I0=Ia+It透光率T=It/I0第11頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

分光光度法

基本原理I0溶劑

I0,

I0溶液

It∴T=It/I0

透光率的負對數(shù)稱為吸光度，用符號A表示。

A愈大，溶液對光的吸收愈多。吸光度A=-lgT=lgI0/It第12頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

分光光度法

基本原理二

Lambert―Beer定律當I0一定時，A只與液層厚度（b）和溶液濃度C有關(guān)：①Io，c一定，A∝b

②Io，b一定,A∝c∴A=abc注意：Beer定律僅適用于單色光。第13頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

物質(zhì)的吸收光譜

單位：

b----cm。

a為吸光系數(shù)：Lg-1cm-1,c單位:g/L。

ε為摩爾吸光系數(shù)：L·mol-1·cm-1，c單位：mol/L，

a與ε的關(guān)系:ε=aM

M表示被測物質(zhì)的摩爾質(zhì)量。第14頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

分光光度法

基本原理由Lambert―beer定律

可知吸光度與溶液濃度之間為正比關(guān)系，而透光率與溶液濃度之間為指數(shù)函數(shù)關(guān)系：-lgT=

bc

T=10-bc第15頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

分光光度法基本原理例：已知某化合物的相對分子質(zhì)量為251，將此化合物用乙醇配成濃度為0.150mmolL-1的溶液，在480nm波長處用2.00cm吸收池測得透光率為39.8%，求該化合物在上述條件下的摩爾吸光系數(shù)及質(zhì)量吸光系數(shù)a。解：第16頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

分光光度法基本原理例：測試酶與腺苷酸(AMP)體系的吸光度如下A(280nm)=0.46，A(260nm)=0.58，試計算每一組分的濃度。已知：酶的(280nm)=2.96104Lmol-1cm-1(260nm)=1.52104Lmol-1cm-1

AMP的(280nm)=2.4103Lmol-1cm-1(260nm)=1.5104Lmol-1cm-1吸收池厚度為1.00cm。第17頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)可見分光光度法

一分光光度計分光光度計儀器型號很多，但其基本原理相似，其主要部件用方框圖示意如下光源→單色光器→吸收池→檢測器→訊號處理及顯示器第18頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)可見分光光度法二、測定方法

可見分光光度法常用于定量測定，根據(jù)Lambert-Beer定律，在一定波長條件下，吸光度與濃度成正比，因此在分光光度計上測出吸光度，通過下列方法即可求出被測物質(zhì)含量:第19頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)可見分光光度法1.標準曲線法在測定溶液吸光度時，為了消除溶劑或其它物質(zhì)對入射光的吸收，以及光在溶液中的散射和吸收池界面對光的反射等與被測物吸收無關(guān)的因素的影響，必須采用空白溶液(又稱參比溶液)作對照。常用的空白溶液有下列三種。①溶劑空白②試劑空白③試樣空白第20頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)可見分光光度法2.標準對照法先配制一個與被測溶液濃度相近的標準溶液(其濃度用cs表示)，在max處測出吸光度As，在相同條件下測出試樣溶液的吸光度Ax，則試樣溶液濃度cs可按下式求得：cx=csAx/As第21頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)

提高測量靈敏度和準確度的方法一、分光光度法的誤差分光光度法的誤差主要來自以下幾方面：1.溶液偏離Beer定律引起的誤差測定條件：均勻穩(wěn)定的稀溶液，單色光。2.儀器誤差，A為0.2～0.7,誤差較小。3.主觀誤差。第22頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月

第四節(jié)

提高測量靈敏度和準確度的方法二選擇合適的顯色劑條件：

1.靈敏度

2.選擇性高

3.生成的有色物質(zhì)有確定的組成

4.生成的有色物質(zhì)要穩(wěn)定

5.顯色劑在測定波長處無明顯吸收。第23頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月

第四節(jié)

提高測量靈敏度和準確度的方法三、選擇合適的測定條件

1.波長的選擇（入max）；

2.顯色劑的用量要適量；

3.酸度（A–pH曲線）；

4.顯色時間（A–t曲線）；

5.溶液濃度控制在A=0.2~0.7范圍;

6.掩蔽干擾離子。第24頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月

第五節(jié)紫外分光光度法簡介

一、751-G型分光光度計二、紫外分光光度法的應(yīng)用1.定性鑒別比較max、(max)或a(max)比較吸光度(或吸光系數(shù)的比值)2.定量測定3.有機化合物的結(jié)構(gòu)研究第25頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月第五節(jié)紫外分光光度法簡介例已知維生素B12的α(361nm)=20.7Lg-1cm-1。精密稱取樣品30.0mg，加水溶解后稀釋至1000ml，在波長361nm處用1.00cm吸收池測得樣品的吸光度為0.618，計算樣品溶液中維生素B12的質(zhì)量分數(shù)。解

所測樣品溶液中維生素B12的質(zhì)量濃度：第26頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月本章小結(jié)分光光度法是根據(jù)物質(zhì)的吸收光譜及光的吸收定律，對物質(zhì)進行定性、定量分析的一種方法。以入射光的波長()為橫坐標，溶液的吸光度(A)為縱坐標畫出的曲線，即吸收光譜，吸收光譜中吸光度最大的波長，為最大吸收波長，用max表示。第27頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月本章小結(jié)分光光度法測定物質(zhì)含量的依據(jù)是Lambert-Beer定律，即A=bc，此處c為物質(zhì)的量濃度，稱為摩爾吸光系數(shù)，若用質(zhì)量濃度代替物質(zhì)的量濃度c，則相應(yīng)地改為a，A=ab，a為質(zhì)量吸光系數(shù)，a與及物質(zhì)的摩爾質(zhì)量M之間的關(guān)系為：

=aM吸光度A與透光率T的關(guān)系是：A=-lgT第28頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月本章小結(jié)可見分光光度計是以可見光(鎢燈)為光源，而紫外分光光度計是以氫燈作光源，經(jīng)單色器分光后提供所需的波長進入被測溶液。定量測定時，常用的定量方法有標準曲線法、標準對照法、比吸光系數(shù)比較法以及差示分光光度法。它們各有其適用的范圍。第29頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月本章小結(jié)為了提高測量的靈敏度和準確度，必須從以下幾個方面考慮：

1.

提供測定時所需的單色光(一般為max)。

2.溶液的濃度宜小。

3.在A=0.2~0.7的范圍內(nèi)測量。

4.選擇合適的顯色劑。

5.選擇合適的顯色條件。第30頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月本章小結(jié)由于許多物質(zhì)在可見光區(qū)無特征吸收，而在近紫外(200nm~400nm)卻有特征吸收，故需用紫外光為光源進行測定。紫外分光光度法除