微生物保藏及基本操作技術(shù)-姚課件

微生物保藏及基本操作技術(shù)中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心CICC姚粟微生物保藏及基本操作技術(shù)中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心微生物菌種保藏菌種是進(jìn)行微生物學(xué)研究和應(yīng)用的基本材料，是發(fā)展生物工程的重要基礎(chǔ)條件之一，是國(guó)家的重要生物資源。菌種保藏管理要求各保藏中心必須具有保藏菌種的詳細(xì)歷史及有關(guān)實(shí)驗(yàn)資料。并對(duì)其所負(fù)責(zé)保藏的菌種均應(yīng)采取妥善、可靠的方法保藏，避免菌種的污染或死亡。

《中國(guó)微生物菌種保藏管理?xiàng)l例》微生物菌種保藏菌種是進(jìn)行微生物學(xué)研究和應(yīng)用的基本材料，是發(fā)展微生物菌種保藏制訂專門菌種保藏管理制度；同一株菌種采用兩種以上保藏方法保存；對(duì)只能采用一種保藏方法的菌株備份存放于兩個(gè)以上的保藏設(shè)備中；對(duì)菌種的入庫(kù)和出庫(kù)記錄入檔，實(shí)行雙人負(fù)責(zé)制管理；設(shè)專人負(fù)責(zé)管理菌種保藏設(shè)施正常運(yùn)行，定期檢修維護(hù)。微生物菌種保藏制訂專門菌種保藏管理制度；微生物菌種保藏微生物菌種保藏方法基本原理是在挑選優(yōu)良純培養(yǎng)物并使其處于休眠狀態(tài)基礎(chǔ)上，人為地創(chuàng)造一個(gè)有利于休眠的環(huán)境，使其長(zhǎng)期保存后仍能保持菌種原有的優(yōu)良特性。基本措施是低溫、真空、干燥。微生物菌種保藏微生物菌種保藏方法常用菌種保藏方法定期移植法液體石蠟法真空冷凍干燥法-80℃低溫凍結(jié)法液氮超低溫凍結(jié)法常用菌種保藏方法定期移植法定期移植法亦稱傳代培養(yǎng)保藏法，指將菌種接種于適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)，完成培養(yǎng)于4～6℃進(jìn)行保存并間隔一定時(shí)間（3-6個(gè)月）進(jìn)行移植培養(yǎng)的一種短期菌種保藏方法。操作步驟：斜面制備接種培養(yǎng)保藏定期移植法亦稱傳代培養(yǎng)保藏法，指將菌種接種于適宜的斜面培養(yǎng)基

接種接種定期移植法操作簡(jiǎn)單，使用方便；對(duì)設(shè)備和人員要求不高；可隨時(shí)使用，便于觀察菌種；工作勞動(dòng)強(qiáng)度大，屬短期保藏，保藏成本高；菌種傳代頻繁，易退化、污染。定期移植法液體石蠟法指將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)好后注入滅菌的液體石蠟，使其覆蓋整個(gè)斜面，再直立放置于低溫（4～6℃）干燥處進(jìn)行保存的一種菌種保藏方法。液體石蠟法指將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)好

操作步驟：液體石蠟預(yù)處理斜面培養(yǎng)物制備灌注石蠟保藏操作步驟：液體石蠟預(yù)處理斜面培養(yǎng)物制備灌注石蠟保液體石蠟法操作簡(jiǎn)單，使用比較方便；對(duì)設(shè)備要求不高，對(duì)人員操作水平有一定要求；·菌種易退化、污染。液體石蠟法真空冷凍干燥法指將保藏的菌種細(xì)胞或孢子懸浮于保護(hù)劑中，經(jīng)預(yù)凍后在真空條件下使水分升華，再經(jīng)真空封存后保存的一種長(zhǎng)期菌種保存方法。真空冷凍干燥法指將保藏的菌種細(xì)胞或孢子懸浮于保護(hù)劑中，經(jīng)預(yù)凍安瓿管的準(zhǔn)備清洗選用中性玻璃材質(zhì)的安瓿管；2%鹽酸浸泡8～10h，自來(lái)水沖洗至中性，蒸餾水沖洗2～3次；置于烘箱中烘干。棉塞打棉塞，160℃定型2h；標(biāo)簽激光打印標(biāo)簽，標(biāo)明菌株編號(hào)和保藏日期，大小約10×20mm。噴碼于安瓿管外，160℃固定20min。滅菌

121℃，30min.安瓿管的準(zhǔn)備保護(hù)劑的準(zhǔn)備保護(hù)劑：12%脫脂牛奶蒸餾水溶液，2～5ml/管；滅菌鍋加熱至沸騰，將牛奶管放入鍋中，113℃滅菌20min；打開(kāi)放氣閥緩慢排出蒸汽，取出滅菌后脫脂牛奶試管，迅速放入涼水中冷卻；30℃培養(yǎng)2天，無(wú)菌檢查合格后備用。

保護(hù)劑的準(zhǔn)備凍干樣品制備制備斜面培養(yǎng)物；將保護(hù)劑用無(wú)菌吸管注入到斜面培養(yǎng)物上，用吸管刮取斜面上的菌體，使菌體均勻地懸浮在保護(hù)劑內(nèi)。用長(zhǎng)毛細(xì)滴管將菌懸液分裝到安瓿管內(nèi)，0.1～0.2ml/管，操作時(shí)要把帶有菌懸液的長(zhǎng)毛細(xì)滴管直接插入安瓿管的底部，勿使菌液沾在管壁上。凍干樣品制備真空干燥

在開(kāi)動(dòng)真空泵后應(yīng)使真空度在15min內(nèi)達(dá)到66.5Pa，隨后逐漸達(dá)到26.6～13.3Pa，在此條件下，樣品將保持凍結(jié)狀態(tài)，其中水分則不斷升華，干燥才能順利地進(jìn)行。終止干燥時(shí)間應(yīng)根據(jù)下列情況判斷：安瓿管內(nèi)凍干物呈酥塊狀或松散片狀真空度接近空載時(shí)的最高值樣品溫度與管外溫度接近選用1～2支對(duì)照管，其水份與菌懸液同量，當(dāng)其水分完全蒸發(fā)時(shí)視為干燥完結(jié)真空干燥預(yù)凍制備菌懸液、經(jīng)分裝到進(jìn)行預(yù)凍之間的時(shí)間不宜超過(guò)1h；分裝完成后將安瓿管立刻放入－35～－40℃冰箱預(yù)凍1h，使菌液完全凍結(jié)；可采用分段式預(yù)凍，先將分裝好的安瓿管置－20℃凍30分鐘，再放入－80℃冰箱凍30min；采用離心式凍干裝置時(shí)勿需預(yù)凍。預(yù)凍熔封

將安瓿管的中上部用火焰燒軟，拉成細(xì)頸；將安瓿管裝到多歧管上，用火焰在細(xì)頸處熔封；拉管時(shí)注意火焰不要離菌體太近。熔封真空度檢測(cè)

用高頻電火花檢查各安瓿管的真空情況，如管內(nèi)呈現(xiàn)灰藍(lán)光，說(shuō)明真空度符合要求。

真空度檢測(cè)真空冷凍干燥法保藏、運(yùn)輸方便；保藏時(shí)間長(zhǎng)(5～10年)；對(duì)設(shè)備要求高(真空冷凍干燥機(jī)、多歧管)，對(duì)人員操作水平要求高；冷凍干燥過(guò)程對(duì)菌體有損傷，需恢復(fù)培養(yǎng)。真空冷凍干燥法-80℃冰箱凍結(jié)法將菌種懸浮于保護(hù)劑中，在－80℃冰箱中凍結(jié)保存的一種長(zhǎng)期菌種保藏方法。準(zhǔn)備冷凍管準(zhǔn)備保護(hù)劑（10%-15%甘油）準(zhǔn)備菌懸液（細(xì)胞、孢子或芽孢懸液）制備冷凍管（取菌懸液和保護(hù)劑至冷凍管）保藏（-80℃，2～5年）-80℃冰箱凍結(jié)法將菌種懸浮于保護(hù)劑中，在－80℃冰箱中凍結(jié)-80℃冰箱凍結(jié)法使用方便；保藏時(shí)間較長(zhǎng)；對(duì)設(shè)備要求高(-80℃冰箱)；運(yùn)輸不方便。-80℃冰箱凍結(jié)法液氮超低溫凍結(jié)法指懸浮于保護(hù)劑中的菌種經(jīng)程控降溫后，移置于－196℃的液氮或－150℃左右的液氮?dú)庀嘀斜４娴囊环N長(zhǎng)期菌種保藏方法。液氮超低溫凍結(jié)法指懸浮于保護(hù)劑中的菌種經(jīng)程控降溫后，移置于－操作步驟冷凍管準(zhǔn)備保護(hù)劑制備保藏培養(yǎng)物準(zhǔn)備預(yù)凍

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將程序降溫系統(tǒng)預(yù)冷到4℃，將制備好的冷凍管放入其中，以1℃/min降溫速率降至-35℃；

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使用程序降溫盒。保藏

將預(yù)凍后的冷凍管轉(zhuǎn)移至液氮?dú)庀?-150℃)或液相(-196℃)。同“－80℃冰箱凍結(jié)法”

操作步驟同“－80℃冰箱凍結(jié)法”液氮超低溫凍結(jié)法保藏時(shí)間長(zhǎng)；保藏效果好，菌種不易退化；對(duì)設(shè)備要求高(程控降溫儀、液氮罐)，對(duì)人員操作水平要求高；保藏成本高。液氮超低溫凍結(jié)法不同保藏方法的比較不同保藏方法的比較菌種保藏技術(shù)進(jìn)展程序降溫控制技術(shù)凍結(jié)速度對(duì)菌種細(xì)胞的影響冷凍速度慢：細(xì)胞內(nèi)水分外滲多，細(xì)胞脫水，體積收縮。冷度速度快：細(xì)胞內(nèi)水分沒(méi)有足夠時(shí)間外滲，細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰。冷凍速度非?？欤杭?xì)胞內(nèi)冰晶非常小或稱玻璃化狀態(tài)。菌種保藏技術(shù)進(jìn)展程序降溫控制技術(shù)凍結(jié)速度對(duì)菌種細(xì)胞的影響冷凍原位低溫保藏技術(shù)有些菌種不可培養(yǎng)，也無(wú)法采用標(biāo)準(zhǔn)的冷凍干燥技術(shù)保藏，如一些致病菌、無(wú)法培養(yǎng)的菌種或者與其他微生物共生的菌種（如菌根真菌）等。這些菌種可采用原位低溫保藏技術(shù)，這一技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用在一些銹菌種的保藏過(guò)程中。Teliospores:Pucciniaspp。Source:http://doacs.state.fl.us/~pi/enpp/pathology/images/dayl.菌種保藏技術(shù)進(jìn)展Teliospores:Pucciniaspp。菌種包埋固定化技術(shù)是在藻酸鈣顆?；蚱渌|(zhì)中進(jìn)行的。含有藻酸鈉的菌懸浮液加入氯化鈣后會(huì)形成藻酸鈣固定化細(xì)胞，細(xì)胞一旦固定化，便可采取傳統(tǒng)的凍干保藏方法進(jìn)行保藏。這種固定化技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用在真菌中，并延伸至線蟲和藻類。Myceliumradiatingfromanalginatebeadonanagarplate.?M.Ryan/Mycologist15:66-69菌種保藏技術(shù)進(jìn)展包埋固定化技術(shù)Myceliumradiatingfrom玻璃化技術(shù)就是用極快的冷卻速率，使細(xì)胞及其所處的溶液來(lái)不及形成冰晶，一下子以“非晶體”的方式固化下來(lái)，可以阻止冰晶體對(duì)細(xì)胞的破壞作用。對(duì)于1微米直徑的純凈水滴，只有當(dāng)冷卻速率高達(dá)107℃/秒時(shí)才能實(shí)現(xiàn)“玻璃化”。

菌種保藏技術(shù)進(jìn)展玻璃化技術(shù)菌種保藏技術(shù)進(jìn)展標(biāo)準(zhǔn)菌株要求藥品微生物檢驗(yàn)用的試驗(yàn)菌應(yīng)來(lái)自認(rèn)可的國(guó)內(nèi)或國(guó)外菌種收藏機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)菌株，或使用與標(biāo)準(zhǔn)菌株所有相關(guān)特性等效的商業(yè)派生菌株。312010版中國(guó)藥典《藥品微生物實(shí)驗(yàn)室規(guī)范指導(dǎo)原則》標(biāo)準(zhǔn)菌株要求312010版中國(guó)藥典《藥品微生物實(shí)驗(yàn)室規(guī)范指導(dǎo)國(guó)內(nèi)認(rèn)可的菌種收藏機(jī)構(gòu)1979年7月，全國(guó)第一屆菌種保藏管理會(huì)議正式成立中國(guó)菌種保藏管理委員會(huì)（CCCCM），委員會(huì)下設(shè)7個(gè)全國(guó)性菌種保藏管理中心及機(jī)構(gòu)所在地：普通微生物菌種保藏管理中心（CCGMC）,中國(guó)科學(xué)院微生物研究所農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ACCC）,中國(guó)農(nóng)科院區(qū)劃所工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC），中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心（CMCC），中國(guó)藥品生物制品鑒定所抗菌素菌種保藏管理中心（CACC），中國(guó)醫(yī)科院醫(yī)用生物技術(shù)研究所獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心（CVCC），農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)藥品監(jiān)察所林業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CFCC），中國(guó)林業(yè)科學(xué)院

國(guó)內(nèi)認(rèn)可的菌種收藏機(jī)構(gòu)1979年7月，全國(guó)第一屆菌種保藏管理國(guó)認(rèn)外可的菌種收藏機(jī)構(gòu)世界菌種保藏聯(lián)合會(huì)WFCC(WorldFederationOfCultureCollection)全球注冊(cè)的菌種保藏機(jī)構(gòu)583家ATCCNRRLDSMZNCTCCMICBSNBRC(IFO)JCM國(guó)認(rèn)外可的菌種收藏機(jī)構(gòu)世界菌種保藏聯(lián)合會(huì)WFCC(Worl標(biāo)準(zhǔn)菌株提供形式AccuracyEasyofUse(preparation)HighLowComplicatedEasyQuantiCult(REMEL)StandardStrains(ATCC/NBRC