葡萄糖氧化酶-生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件

實(shí)驗(yàn)專題模塊一血糖和血糖的調(diào)節(jié)血清葡萄糖測(cè)定糖化血清蛋白（果糖胺）測(cè)定實(shí)驗(yàn)專題模塊一血糖和血糖的調(diào)節(jié)血清葡萄糖測(cè)定生化實(shí)驗(yàn)室守則請(qǐng)同學(xué)們仔細(xì)閱讀《生化實(shí)驗(yàn)室守則》，并注意遵守。生化實(shí)驗(yàn)室守則請(qǐng)同學(xué)們仔細(xì)閱讀《生化實(shí)驗(yàn)微量移液器的使用選擇合適的移液器。吸頭安裝。容量設(shè)定。預(yù)洗吸頭：在我們安裝了新的吸頭或增大了容量值以后，應(yīng)該把需要轉(zhuǎn)移的液體吸取、排放兩到三次。吸液：先將移液器排放按鈕按至第一停點(diǎn)，再將吸頭垂直進(jìn)入液面，浸入的深度為：P2、P10小于或等于1毫米，P20、P100、P200小于或等于2毫米，P1000小于或等于3毫米，P5ml、P10ml小于或等于4毫米，平穩(wěn)松開(kāi)按鈕，切記不能過(guò)快。放液：放液時(shí)，吸頭緊貼容器壁，先將移液器排放按鈕按至第一停點(diǎn)，略做停頓后，再按至第二停點(diǎn)。卸去吸頭：用過(guò)的吸頭如果不用了，可以用拇指按住移液器頂端的另一個(gè)按鈕，把槍頭打掉。移液器容量復(fù)原：使用完畢，把槍調(diào)到最大量程，這樣有利于槍的保養(yǎng)。微量移液器的使用葡萄糖氧化酶-生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件葡萄糖氧化酶-生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件葡萄糖氧化酶-生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件糖尿病是由于胰島素分泌不足或/和胰島素作用低下而引起的代謝紊亂綜合征，高血糖是其最主要特征。根據(jù)病因，糖尿病可分為不同類型，主要包括1型、2型、其他特殊類型糖尿病和妊娠期糖尿病等。最近30年我國(guó)糖尿病患病率急速增長(zhǎng)，約增長(zhǎng)了15倍,成為世界第一糖尿病大國(guó)。中國(guó)最新流行病學(xué)調(diào)查顯示，2型糖尿病在成年人高度流行，年齡標(biāo)化的總糖尿病患病率為9.7%。正常血糖是空腹靜脈血漿葡萄糖<3.89～6.11mmol/L。若空腹血糖>7.00mmol/L和餐后2小時(shí)血糖>11.10mmol/L即為糖尿病。糖化血清蛋白（果糖胺）測(cè)定可反映糖尿病患者抽血前2-3周內(nèi)血糖總的水平，亦為糖尿病病人近期監(jiān)測(cè)指標(biāo)，正常值為1.7～2.8mmol/L。HbA1c測(cè)定可反映糖尿病患者抽血前8～12周的血糖控制情況，病情控制不良的糖尿病病人其HbA1c較正常人高，且與病情控制不良程度相關(guān)，正常值為<6.5%。血漿胰島素和C肽測(cè)定有助于了解胰島B細(xì)胞功能和指導(dǎo)治療，空腹血漿胰島素正常值為5～15mU/L，正常人血漿基礎(chǔ)C肽水平300～600pmol/L。糖尿病糖尿病是由于胰島素分泌不足或/和胰島素作用低下而引起的代謝紊實(shí)驗(yàn)一血清葡萄糖測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握血糖的基本知識(shí)及空腹血糖、餐后血糖檢測(cè)在糖尿病診療中的應(yīng)用。2.掌握葡萄糖氧化酶法測(cè)定血清葡萄糖濃度的原理與操作過(guò)程。實(shí)驗(yàn)一血清葡萄糖測(cè)定二、背景與原理（一）背景應(yīng)用酶學(xué)方法測(cè)定血液葡萄糖是臨床化學(xué)中的主流方法。最常用的酶學(xué)方法有葡萄糖氧化酶法和己糖激酶法。其特點(diǎn)是具有較高的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度，使用溫和的反應(yīng)條件，操作簡(jiǎn)單方便，適用于自動(dòng)分析儀。己糖激酶法：第一步是在己糖激酶催化下，葡萄糖和ATP發(fā)生磷酸化反應(yīng)，生成葡萄糖-6-磷酸；第二步是在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶催化下，葡萄糖-6-磷酸和NAD或NADP發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成6-磷酸葡萄糖酸和NADH或NADPH。在波長(zhǎng)340nm處，監(jiān)測(cè)吸光度的增高。吸光度的凈增高值與葡萄糖濃度成正比。己糖激酶方法和葡萄糖氧化酶方法相比對(duì)葡萄糖的特異性更高，不受尿酸和抗壞血酸的干擾，特別適用于急診檢驗(yàn)使用。二、背景與原理葡萄糖氧化酶：本法分極譜分析法和比色法兩類。但二者的初反應(yīng)都是在葡萄糖氧化酶的催化下，葡萄糖被氧化成葡萄糖酸，同時(shí)消耗溶液中的氧，產(chǎn)生過(guò)氧化氫。極譜分析法是用氧電極監(jiān)測(cè)溶液中氧的消耗量，氧的消耗量與葡萄糖濃度成正比。比色分析法是用葡萄糖氧化酶和辣根過(guò)氧化物酶的偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)。初始反應(yīng)中過(guò)氧化氫的生成量與葡萄糖濃度成正比。在辣根過(guò)氧化物酶進(jìn)行比色測(cè)定。該法的缺點(diǎn)是易受還原性物質(zhì)如膽紅素、抗壞血酸和尿素等干擾，但準(zhǔn)確度與精密度都能達(dá)到臨床要求，操作簡(jiǎn)便，是目前臨床推薦常規(guī)檢驗(yàn)的方法。葡萄糖氧化酶：本法分極譜分析法和比色法兩類。但二者的初反應(yīng)都（二）原理葡萄糖氧化酶（GOD）催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸（D-葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯），并產(chǎn)生一分子過(guò)氧化氫。在色原性受體（4-氨基安替比林偶氮酚）的存在下，過(guò)氧化物酶（POD）可將過(guò)氧化氫分解為水和氧，并使4-氨基安替比林和酚去氫縮合成紅色醌亞胺，即Trinder反應(yīng)。紅色的醌類化合物生成量與葡萄糖含量成正比。其反應(yīng)如下：

2葡萄糖+2H2O+O2

2葡萄糖酸+2H2O22H2O2+4-氨基安替比林+酚

醌亞胺+4H2O醌亞胺在480～550nm波長(zhǎng)有最大吸收，與同樣處理的標(biāo)準(zhǔn)液比較，經(jīng)計(jì)算可求出血漿葡萄糖含量。GODPOD（二）原理GODPOD四、實(shí)驗(yàn)操作1.準(zhǔn)備健康成年家兔三只（每個(gè)實(shí)驗(yàn)班），常規(guī)飼養(yǎng)。2.將三只家兔固定在兔盒上，割破耳沿靜脈并留取對(duì)照血液1-2ml，凝固后分離出血清備用【血清分離：待凝固后（約20-30分鐘），3000～5000rpm，離心5～10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中】。3.按2U/kg體重給第一只兔子注射胰島素，然后用采血管分別在注射后45分鐘和90分鐘等時(shí)間點(diǎn)，割破家兔耳朵血管，留取家兔血液各1-2ml，分離出血清后備用。4.按0.4ml/kg體重給第二只兔子注射0.1%的腎上腺素，然后用采血管分別在注射后30分鐘和60分鐘等時(shí)間點(diǎn)，割破家兔耳朵血管，留取家兔血液各1-2ml，分離出血清后備用。四、實(shí)驗(yàn)操作5.第三只兔子的處理：先按2U/kg體重給兔子注射胰島素，45分鐘后割破家兔耳朵血管，留取血液1-2ml；馬上按0.4ml/kg體重給予注射0.1%的腎上腺素，30分鐘后留取血液1-2ml。以上血液均分離出血清備用。（以下實(shí)驗(yàn)中，整個(gè)實(shí)驗(yàn)班以6人/組分組，在各個(gè)組中，每?jī)蓚€(gè)人負(fù)責(zé)一只兔子的樣品檢測(cè)）。6.氧化酶法測(cè)定血糖：取試管，做好標(biāo)注后，按下表進(jìn)行操作：加入物(ml)測(cè)定管 標(biāo)準(zhǔn)管空白管血清（以上各實(shí)驗(yàn)組獲得）0.0200葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液00.020蒸餾水000.02酶酚混合試劑2.02.02.05.第三只兔子的處理：先按2U/kg體重給兔子注射胰島素，混勻后，置于37℃水浴箱中，恒溫水浴15分鐘。然后用722型分光光度計(jì)，波長(zhǎng)505nm，以空白管調(diào)零，分別讀取標(biāo)準(zhǔn)管和測(cè)定管吸光度，并按以下公式計(jì)算結(jié)果：血清葡萄糖（mmol/L）=（測(cè)定管吸光度/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度）×標(biāo)準(zhǔn)液濃度7.并將所測(cè)得的結(jié)果記錄在實(shí)驗(yàn)記錄本上，每只兔子的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理完后，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，血糖濃度為縱坐標(biāo)作曲線圖。分析胰島素和腎上腺素對(duì)血糖的影響?；靹蚝?，置于37℃水浴箱中，恒溫水浴15分鐘。然后用722型實(shí)驗(yàn)二糖化血清蛋白（果糖胺）測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握糖化血清蛋白（果糖胺）檢測(cè)在糖尿病診療中的應(yīng)用。2.了解NBT底物法檢測(cè)糖化血清蛋白（果糖胺）的原理與操作。實(shí)驗(yàn)二糖化血清蛋白（果糖胺）測(cè)定二、背景與原理（一）背景糖化血清蛋白（果糖胺）是血清蛋白質(zhì)與葡萄糖非酶糖化過(guò)程中形成的高分子酮胺結(jié)構(gòu)，類似果糖胺的物質(zhì)，又被稱為血清果糖胺。其生成量與血糖濃度相關(guān)，并相對(duì)保持穩(wěn)定，它的測(cè)定結(jié)果的高低卻不受抽血時(shí)血糖濃度的影響。由于人血清果糖胺的代謝周期與血清蛋白相同，半衰期為17～20天，在2～3周內(nèi)發(fā)生代謝變化，故果糖胺可以反映糖尿病患者檢測(cè)前2～3周內(nèi)的平均血糖水平，是評(píng)價(jià)糖尿病控制情況的一個(gè)良好指標(biāo)，尤其是對(duì)血糖波動(dòng)較大的脆性糖尿病及妊娠糖尿病，了解其平均血糖水平有實(shí)際意義。血清果糖胺正常值為1.64～2.64mmol/L，血漿中果糖胺較血清低0.3mmol/L。二、背景與原理（二）原理血清葡萄糖能與白蛋白及其他血清蛋白分子N-末端的氨基發(fā)生非酶促糖化反應(yīng)，形成高分子酮胺結(jié)構(gòu)。此酮胺結(jié)構(gòu)能在堿性環(huán)境中與硝基四氮唑藍(lán)（NBT）發(fā)生還原反應(yīng)，生成有色物質(zhì)甲撍，與1-脫氧-1-嗎啉果糖（DMF）為標(biāo)準(zhǔn)參照物進(jìn)行比色測(cè)定，顏色深淺與血糖濃度成正比。（二）原理NBT底物法檢測(cè)糖化血清蛋白（果糖胺）操作步驟

加入物(ml)樣品管校準(zhǔn)品管空白管血清0.05標(biāo)準(zhǔn)品0.05蒸餾水0.05試劑1.01.01.01.混勻，立即在分光光度計(jì)上進(jìn)行檢測(cè)（先用空白管在波長(zhǎng)540nm處調(diào)零），并啟動(dòng)計(jì)時(shí)表。2.三分種后，記錄起始吸光度，然后每隔一分鐘記錄一次，共三分鐘（為什么？）。3.計(jì)算出平均△A/min。4.計(jì)算:果糖胺的含量=（△A/min樣品/△A/min校準(zhǔn)品）×校準(zhǔn)品濃度NBT底物法檢測(cè)糖化血清蛋白（果糖胺）操作步驟 加入物(m課堂分組討論我學(xué)院負(fù)責(zé)衛(wèi)生的王阿姨今年48歲，平時(shí)體健。近半年來(lái)不明原因消瘦