丙型肝炎病毒抗體檢測（酶聯(lián)免疫法）

丙型肝炎病毒抗體檢測（酶聯(lián)免疫法）1、原理：本法采用間接法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)原理。在微孔條上預(yù)包被基因重組HCV結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)區(qū)，配以酶標(biāo)記IgG抗體及TMB顯色等其他試劑，檢測人血清或血漿中的丙型肝炎病毒抗體。2、標(biāo)本采集與處理?2.1受檢者準(zhǔn)備：對于體檢對象抽血前保持平時(shí)的飲食習(xí)慣，采血前應(yīng)禁食4—6小時(shí)。2.2靜脈采血：除非是臥床病人，一般在采血時(shí)取坐位。體位影響水分在血管內(nèi)外的分布，因此影響測定水平。故在采血前至少應(yīng)靜坐５分鐘。一般從肘靜脈取血，使用止血帶的時(shí)間不超過１分鐘，穿刺成功后立即松開止血帶。2.3采血管：一般采用血清作檢驗(yàn)，可以用一般潔凈的塑料管或玻璃試管作為容器。2.4標(biāo)本處理：血液標(biāo)本應(yīng)盡快地送實(shí)驗(yàn)室。本試劑使用樣品為人血清或血漿，含EDTA、檸檬酸鈉或肝素等抗凝劑的樣品可用于本實(shí)驗(yàn)。2.5標(biāo)本接收：接收標(biāo)本時(shí)應(yīng)檢查標(biāo)本是否符合要求（要求密封、無溶血、無雜物）、所用試管是否正確、試管是否填寫完整、并問詢采血日期，對不合格標(biāo)本應(yīng)退回重采，并填寫記錄。2.6標(biāo)本儲存：樣品中應(yīng)無微生物，可在2-8oc儲存1周，長期儲存應(yīng)低溫凍存，避免反復(fù)凍融。3、試劑3.1測定試劑：3.1.1生產(chǎn)廠商：珠海麗珠生物藥業(yè)股份有限公司3.1.2批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字S200100143.1.3包裝：96T×1試劑配置：濃縮洗滌液50ml×1瓶樣品稀釋液12ml×1瓶HCV酶標(biāo)板8×12孔或12×8孔HCV酶標(biāo)試劑12ml×1瓶HCV陽性對照0.2ml×1支HCV陰性對照0.2ml×1支底物液A、B液各6ml×1瓶終止液6ml×1瓶自封袋1個(gè)封版膜2張說明書1份4、操作步驟：4.1配液：濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水20倍稀釋。4.2編號：將樣品對應(yīng)微孔按序編號，每板應(yīng)設(shè)陰性對照3孔，陽性對照2孔和空白對照1孔（空白對照孔只加稀釋液不加樣品及酶標(biāo)試劑）其余各孔加入100UL樣本稀釋液。4.3加樣：分別在相應(yīng)孔中加入待測樣品，陰，陽對照10微升，輕輕振蕩混勻。4.4溫育：用封版膜封版后，置37℃溫育60分鐘。4.5洗滌：揭掉封版膜，用洗板機(jī)洗滌5遍，最后一次盡量扣干。4.6加酶標(biāo)抗體：空白對照孔不加酶標(biāo)試劑，每孔加入酶標(biāo)記抗體100微升，輕輕振蕩混勻。4.7溫育：置37℃溫育30分鐘。4.8洗滌：揭掉封版膜，用洗板機(jī)洗滌5遍，最后一次盡量扣干4.9顯色：每孔加入顯色劑A，B液各1滴（50微升），輕輕振蕩勻，37℃避光顯色30分鐘。4.10終止：每孔加終止液1滴（50微升），輕輕振蕩混勻。4.11測定：10分鐘內(nèi)測定結(jié)果，設(shè)定酶標(biāo)儀單波長450nm或雙波長450nm/600-650nm測定。用空白孔調(diào)零點(diǎn)后測定各孔A值。5結(jié)果判斷5.1目測：在白色背景下觀察各孔顯色情況，有明顯黃色者為丙型肝炎病毒抗體（抗HCV）陽性；無色者為丙型肝炎病毒抗體（抗HCV）陰性。5.2酶標(biāo)儀檢測：5.2.1臨界值（CUT/OFF）計(jì)算：CUT/OFF=陰性對照孔A均值+0.12（不足0.02按0.02計(jì)算）5.2.2陽性判定：樣品A值≥臨界值（CUTOFF）者判為抗HCV陽性。（注意初試陽性應(yīng)重新取樣雙孔復(fù)試）5.2.3陰性判定：樣品A值〈臨界值（CUTOFF）者判為抗HCV陰性。6、注意事項(xiàng)：6.1本品僅用于體外診斷，操作應(yīng)按說明書嚴(yán)格進(jìn)行。封版膜不能重復(fù)使用，不同批號酶標(biāo)板、酶標(biāo)試劑和陰陽對照不可混用，不能與其他廠家試劑混用。6.2避免在有揮發(fā)性物質(zhì)及次氯酸類消毒劑（如84消毒液）的環(huán)境下操作。6.3使用前請將試劑平衡至室溫（平衡30分鐘以上）實(shí)驗(yàn)前將試劑輕輕振蕩混勻，使用后立即放回2-8℃.未用完的微孔板條與干燥劑一起用自封袋密封2-8℃保存。過期試劑請勿使用。6.4加樣時(shí)必須使用加樣器，并經(jīng)常校對加樣器的準(zhǔn)確性。加入不同樣品或不同試劑組分時(shí)，用更換加樣器吸頭和加樣槽，以防出現(xiàn)交叉污染。6.5洗滌時(shí)各孔均需加滿洗液，防止孔內(nèi)有游離酶不能洗凈。使用洗板機(jī)應(yīng)設(shè)定30—60秒浸泡時(shí)間。在洗板結(jié)束后，必須立即進(jìn)行下一步，不可使酶標(biāo)板干燥。避免長時(shí)間的中斷實(shí)驗(yàn)步驟，以確保每孔實(shí)驗(yàn)條件的均一。6.6結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)。讀取結(jié)果時(shí)，應(yīng)擦干酶標(biāo)板底部，且孔內(nèi)不能有氣泡。不要觸碰孔底部的外壁，指印或劃痕都可能影響板孔的讀值。6.7所有樣品、廢液和廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。終止液為硫酸，使用時(shí)必須注意安全。6.8顯色時(shí)必須加顯色劑A液后再加顯色劑B液，以免顯色過低。6.