第六章免疫比濁分析課件

第六章免疫比濁分析第六章免疫比濁分析免疫比濁分析是將液相內(nèi)的沉淀反應(yīng)與現(xiàn)代光學(xué)儀器和自動(dòng)分析技術(shù)相結(jié)合的一項(xiàng)分析技術(shù)。免疫比濁分析是將液相內(nèi)的沉淀反應(yīng)與現(xiàn)代光學(xué)儀器第二節(jié)自動(dòng)化免疫比濁分析第一節(jié)免疫比濁的原理一、透射免疫比濁法二、散射免疫比濁法三、免疫膠乳比濁法四、免疫比濁分析的影響因素和臨床應(yīng)用第二節(jié)自動(dòng)化免疫比濁分析第一節(jié)免疫比濁的原理第一節(jié)免疫濁度分析原理

抗原、抗體在特定的電解質(zhì)溶液中反應(yīng)，形成小分子免疫復(fù)合物（<19S），在增濁劑（如PEG、NaF等）的作用下，迅速形成免疫復(fù)合物微粒（>19S），使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。這種濁度可用儀器檢測(cè)，用吸光度表示。第一節(jié)免疫濁度分析原理抗原、抗體在特定的電解質(zhì)第一節(jié)免疫濁度分析原理

在抗體稍微過(guò)量且固定的情況下，形成的免疫復(fù)合物量隨抗原量的增加而增加，反應(yīng)液的濁度亦隨之增大，即待測(cè)抗原量與反應(yīng)溶液的濁度呈正相關(guān)。

第一節(jié)免疫濁度分析原理在抗體稍微過(guò)量且固定的情免疫比濁技術(shù)分類：透射免疫比濁法（turbidimetricimmunoassay）散射免疫比濁法（nephelometryimmunoassay）速率散射比濁法終點(diǎn)散射比濁法免疫比濁技術(shù)分類：透射免疫比濁法散射免疫比濁法速率散射比濁法第六章免疫比濁分析課件一定波長(zhǎng)的入射光線通過(guò)抗原抗體反應(yīng)后的溶液時(shí)，由于溶液中的免疫復(fù)合物微粒對(duì)光線的吸收、反射和折射而使透射光減少，可用吸光度表示。在一定范圍內(nèi)，吸光度與免疫復(fù)合物量呈正相關(guān)，而形成的免疫復(fù)合物量與參與反應(yīng)的抗原和抗體的量呈函數(shù)關(guān)系。一、免疫透射比濁法（一）原理：一定波長(zhǎng)的入射光線通過(guò)抗原抗體反應(yīng)后的溶液時(shí)，由于溶抗原抗體反應(yīng)曲線抗原抗體反應(yīng)曲線1.將待檢標(biāo)本和抗原參考品作適當(dāng)稀釋。（二）操作方法2.將待測(cè)標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)抗原溶液（5個(gè)濃度抗原標(biāo)準(zhǔn)品）與適當(dāng)過(guò)量的抗血清混合，在一定條件下，抗原抗體反應(yīng)完成后，在340nm處測(cè)定各管吸光度。

3.按log-logit轉(zhuǎn)換或y=ax3+bx2+cx+d方程進(jìn)行曲線擬合，制備劑量-反應(yīng)曲線，由計(jì)算機(jī)處理，計(jì)算出抗原濃度。1.將待檢標(biāo)本和抗原參考品作適當(dāng)稀釋。（二）操作方法2.待測(cè)的抗原抗體復(fù)合物分子量足夠大?？乖贵w復(fù)合物數(shù)量足夠多。具有充分的反應(yīng)時(shí)間，只能測(cè)定抗原抗體反應(yīng)的第二階段。高親和力的抗體，并保證抗體過(guò)量。（三）技術(shù)要求

（三）技術(shù)要求（四）方法評(píng)價(jià)

優(yōu)點(diǎn):靈敏度高，穩(wěn)定性好，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確

不足:

①抗體用量較大；②溶液中存在的抗原－抗體復(fù)合物分子應(yīng)足夠大③透射比濁測(cè)定在抗原－抗體反應(yīng)的第二階段，檢測(cè)需在抗原抗體反應(yīng)達(dá)到平衡后進(jìn)行，耗時(shí)較長(zhǎng)。

（四）方法評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn):不足:粒子對(duì)光線的散射作用是溶液中的微粒子受到光線照射后，微粒子對(duì)光線產(chǎn)生反射和折射而形成散射光。懸浮微粒對(duì)光散射形成的散射光強(qiáng)度與微粒的大小、數(shù)量、入射光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度、測(cè)量角度等因素密切相關(guān)。二、免疫散射比濁法(一)原理粒子對(duì)光線的散射作用是溶液中的微粒子受到光線照射不同大小的微粒形成的散射光分布不同。當(dāng)微粒直徑小于入射光的波長(zhǎng)的十分之一時(shí)，散射光的強(qiáng)度在各個(gè)方向的分布均勻一致，稱Rayleighae散射。當(dāng)微粒直徑大于或等于入射光的波長(zhǎng)時(shí)，前向散射光遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于后向散射光，稱Mile散射。不同大小的微粒形成的散射光分布不同。第六章免疫比濁分析課件其中光線偏轉(zhuǎn)的角度與發(fā)射光的波長(zhǎng)和抗原抗體復(fù)合物的大小和多少密切相關(guān)。當(dāng)固定檢測(cè)角度與發(fā)射光的波長(zhǎng)時(shí)，散射光的強(qiáng)度與復(fù)合物的含量成正比，即待測(cè)的抗原越多，形成的復(fù)合物越多，散射光就越強(qiáng)。其中光線偏轉(zhuǎn)的角度與發(fā)射光的波長(zhǎng)和抗原抗體復(fù)合物

應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)墓庠磸?qiáng)度、反應(yīng)時(shí)間、測(cè)量角度及光源的波長(zhǎng)。另外，要注意保證抗原濃度合適。此外，還要選擇適宜的離子強(qiáng)度、pH值等。(二)技術(shù)要求應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)墓庠磸?qiáng)度、反應(yīng)時(shí)間、測(cè)量角度及光源的速率散射比濁法是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的一種動(dòng)態(tài)測(cè)定方法。所謂速率是指抗原抗體反應(yīng)在單位時(shí)間內(nèi)形成免疫復(fù)合物的量（不是免疫復(fù)合物累積的量），連續(xù)測(cè)定各時(shí)間復(fù)合物形成的速率與其產(chǎn)生的散射光信號(hào)聯(lián)系在一起，形成動(dòng)態(tài)的速率散射比濁法，每項(xiàng)檢測(cè)僅1～2min即可完成。

(三)速率散射比濁法（ratenephelometry）速率散射比濁法是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的一種動(dòng)態(tài)測(cè)定方法累計(jì)時(shí)間復(fù)合物產(chǎn)生總量產(chǎn)生速率510152025303540455055608132560150230300360415450480500—512359080706055453020

抗原抗體復(fù)合物形成時(shí)間與速率的關(guān)系累計(jì)時(shí)間復(fù)合物產(chǎn)生總量產(chǎn)生速率58—抗原抗體復(fù)合物形成時(shí)間當(dāng)抗體的濃度固定于一定范圍時(shí)，復(fù)合物形成的速率峰值的高低與抗原的含量成正比，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，免疫復(fù)合物的量逐漸增多，抗原抗體結(jié)合速度的峰值在一定的時(shí)間出現(xiàn)。通過(guò)微機(jī)處理即可得到待測(cè)蛋白成份的含量。當(dāng)抗體的濃度固定于一定范圍時(shí)，復(fù)合物形成第六章免疫比濁分析課件

速率散射比濁法峰值出現(xiàn)的時(shí)間與抗體濃度及純度直接相關(guān)，需選用抗體純度及親和力交高的試劑。此外，要保證待測(cè)樣本血清的性狀符合要求，如嚴(yán)重脂血等即為不合格樣本。技術(shù)要求速率散射比濁法峰值出現(xiàn)的時(shí)間與抗體濃度及純度直接(三)方法評(píng)價(jià)散射比濁法是目前臨床應(yīng)用較多的一種方法，本法自動(dòng)化程度高，具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、精密等優(yōu)點(diǎn)。采用抗原過(guò)量檢測(cè)方法，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。但儀器和試劑價(jià)格比較貴,對(duì)抗體的質(zhì)量要求很高。(三)方法評(píng)價(jià)散射比濁法是目前臨床應(yīng)用較多的一種方法用抗體致敏的大小適中、均勻一致的膠乳顆粒（一般為0.2μm），在遇到相應(yīng)抗原時(shí)，膠乳顆粒上的抗體與抗原特異結(jié)合，引起膠乳顆粒凝聚

，使透射光和散射光即出現(xiàn)顯著變化。三、免疫膠乳比濁法（一）原理：用抗體致敏的大小適中、均勻一致的膠乳顆粒（一般為0.三、免疫膠乳比濁法（一）原理：三、免疫膠乳比濁法（一）原理：第二節(jié)自動(dòng)化免疫比濁分析第二節(jié)自動(dòng)化免疫比濁分析（一）BN特種蛋白分析測(cè)定系統(tǒng)該系統(tǒng)的測(cè)定方法是透射免疫比濁法的一種改良。以發(fā)光二極管作為光源，檢測(cè)前向角13～24度的散射光，然后利用硅化光電二極管接收散射光信號(hào)，經(jīng)過(guò)微電腦處理，與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，最后轉(zhuǎn)換成待檢物質(zhì)的濃度。一、主流免疫比濁設(shè)備概況1.測(cè)定原理（一）BN特種蛋白分析測(cè)定系統(tǒng)一、主流免疫比濁設(shè)備概況1.測(cè)系統(tǒng)由分析儀、計(jì)算機(jī)、條碼讀取器、打印機(jī)四部分組成，其中分析儀是主要組成部分，包括散射測(cè)濁儀、自動(dòng)加樣系統(tǒng)、運(yùn)輸裝置和比色杯裝置。

2.儀器基本組成系統(tǒng)由分析儀、計(jì)算機(jī)、條碼讀取器、打印機(jī)四部分組成，BNⅡ、BN100特種蛋白分析分析系統(tǒng)BNⅡ、BN100特種蛋白分析分析系統(tǒng)本系統(tǒng)屬于速率散射比濁分析法，在抗體過(guò)量的前提下，光束通過(guò)抗原抗體復(fù)合物時(shí)所產(chǎn)生的散射光速率變化大小與抗原濃度成正比。速率的峰值通過(guò)電腦處理系統(tǒng)轉(zhuǎn)換成待測(cè)抗原的濃度。1.測(cè)定原理（二）ARRAY分析系統(tǒng)本系統(tǒng)屬于速率散射比濁分析法，在抗體過(guò)量的前提下，光束通過(guò)抗ARRAY系統(tǒng)由分析儀、電腦處理系統(tǒng)、打印機(jī)構(gòu)成，其主要構(gòu)成部分為分析儀，由加液系統(tǒng)、散射測(cè)濁儀、40孔樣本轉(zhuǎn)盤、20孔試劑轉(zhuǎn)盤、軟盤驅(qū)動(dòng)器等組成。2.儀器基本組成ARRAY系統(tǒng)由分析儀、電腦處理系統(tǒng)、打印機(jī)構(gòu)成，其主要Array360、IMMAGE特種蛋白分析分析系統(tǒng)Array360、IMMAGE特種蛋白分析分析系統(tǒng)二、免疫比濁分析的主要影響因素1．抗原抗體比例抗原抗體比例要適當(dāng)。2．抗體的純度與效價(jià)診斷試劑應(yīng)盡可能選擇高純度與高效價(jià)的抗體。3．免疫復(fù)合物的大小及穩(wěn)定性溶液中免疫復(fù)合物顆粒的分散度盡可能相同，顆粒應(yīng)該不容易相互聚集。二、免疫比濁分析的主要影響因素1．抗原抗體比例抗原抗體比4．增聚劑利用增聚劑破壞抗原抗體的水化層，促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。5.離子強(qiáng)度PBS是較好的反應(yīng)液。返回章目錄返回章目錄抗原過(guò)量檢測(cè)

(1)抗體適當(dāng)過(guò)量

(2)對(duì)抗原過(guò)量進(jìn)行閾值限定抗原過(guò)量檢測(cè)(1)抗體適當(dāng)過(guò)量第六章免疫比濁分析課件

免疫比濁分析法主要用于特定蛋白系列檢測(cè)。如免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、κ鏈、λ鏈、免疫球蛋白亞類；補(bǔ)體C3、C4；血漿蛋白如前白蛋白(PAB)、白蛋白(ALB)、α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)、β2-微球蛋白(β2-MG)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF)、銅藍(lán)蛋白(CER)、結(jié)合珠蛋白(HP)、，C-反應(yīng)蛋白(CRP)、載脂蛋白ApoAI、ApoB、脂蛋白(a)、類風(fēng)濕因子(RF)、尿微量蛋白系列和某些治療性藥物濃度等。

三、臨床應(yīng)用免疫比濁分析法主要用于特定蛋白系列檢測(cè)。小結(jié)

經(jīng)典的免疫沉淀反應(yīng)通常是在抗原抗體反應(yīng)的終點(diǎn)進(jìn)行結(jié)果判斷，存在操作繁瑣、費(fèi)時(shí)、敏感度低及難以自動(dòng)化等缺陷。自動(dòng)化免疫比濁分析儀器的問(wèn)世解決了以上的諸多問(wèn)題。小結(jié)經(jīng)典的免疫沉淀反應(yīng)通常是在抗原抗體目前，透射免疫比濁法和散射免疫比濁等方法已常規(guī)運(yùn)用于臨床特定體液蛋白質(zhì)的檢測(cè)，相關(guān)儀器已廣泛應(yīng)用于國(guó)內(nèi)各級(jí)醫(yī)院，成為臨床免疫檢測(cè)的重要手段之一。返回章目錄目前，透射免疫比濁法和散射免疫比濁等方法思考題

1.名詞解釋：透射免疫比濁法、散射免疫比濁法2.免疫比濁分析的基本原理是什么？有哪些類型？3.簡(jiǎn)述免疫比濁分析的主要影響因素。思考題一、選擇題1.速率散射比濁法之所以能比傳統(tǒng)的沉淀反應(yīng)試驗(yàn)大大地縮短時(shí)間，主要是因?yàn)锳.在抗原抗體反應(yīng)的第一階段判定結(jié)果B.不需復(fù)雜的儀器設(shè)備C.使用低濃度的瓊脂或瓊脂糖D.反應(yīng)的敏感度高一、選擇題2.透射免疫比濁法A.測(cè)定光線通過(guò)反應(yīng)混合液時(shí)，被其中IC反射的光的強(qiáng)度B.測(cè)定光線通過(guò)反應(yīng)混合液時(shí)，被其中IC折射的光的強(qiáng)度C.測(cè)定光線通過(guò)反應(yīng)混合液時(shí)，被其中IC吸收的光的強(qiáng)度D.測(cè)定光線通過(guò)反應(yīng)混合液時(shí)，透過(guò)的光的強(qiáng)度3.散射免疫比濁法檢測(cè)的原理A.測(cè)定光線通過(guò)反應(yīng)混合液時(shí)，被其中IC反射的光的強(qiáng)度B.測(cè)定光線通過(guò)反應(yīng)混合液時(shí)，被其中IC折射的光的強(qiáng)度C.測(cè)定光線通過(guò)反應(yīng)混合液時(shí)，被其中IC吸收的光的強(qiáng)度D.測(cè)定光線通過(guò)反應(yīng)混合液時(shí)，透過(guò)的光的強(qiáng)度2.透射免疫比濁法4.單向瓊脂擴(kuò)散法可用于A.抗體定性B.抗體定量C.抗原定性D.抗原定量5.雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，兩種受檢抗原的性質(zhì)完全相同時(shí)，沉淀線出現(xiàn)A.二條直線相交叉B.二條弧線完全融合C.二條弧線部分融合D.二條直線不連接6.火箭免疫電泳達(dá)到終點(diǎn)時(shí)應(yīng)A.火箭峰呈云霧狀B.火箭峰呈圓形C.火箭峰尖而清晰D.E.火箭峰呈紡錘狀4.單向瓊脂擴(kuò)散法可用于7.對(duì)于血清中數(shù)種蛋白質(zhì)抗原成分的分析，常可采用A.免疫電泳法B.單向擴(kuò)散試驗(yàn)C.向擴(kuò)散試驗(yàn)D.火箭免疫電泳8.速率散射比濁法測(cè)定的散射信號(hào)值產(chǎn)生于