金屬-內(nèi)酰胺酶最佳酶抑制物的選擇

金屬-內(nèi)酰胺酶最佳酶抑制物的選擇

近年來(lái)，隨著內(nèi)酰胺抗生素的廣泛應(yīng)用，從金屬向內(nèi)酰胺b型酶的細(xì)菌越來(lái)越多。它具有廣的光譜特性、高效轉(zhuǎn)壞的內(nèi)酰胺抗生素和快速的耐藥性，給抗生素的臨床治療帶來(lái)了巨大困難，并引起了臨床關(guān)注。11.1材料表面1.1.1培養(yǎng)頭孢他啶的細(xì)胞菌收集微生物室日常送檢臨床標(biāo)本,采用MicroScanautoSCAN4半自動(dòng)微生物分析儀,NC21卡,完成各實(shí)驗(yàn)菌株的生化反應(yīng)測(cè)定及抗生素敏感性試驗(yàn),挑選出耐亞胺培南和(或)頭孢他啶的銅綠假單胞菌,用小牛血清-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922,肺炎克雷伯菌ATCC7006003(產(chǎn)ESBLS菌株),銅綠假單胞菌ATCC27853均購(gòu)自衛(wèi)生部藥品生物制品鑒定所,產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶VIM-2、IMP-1、IMP-2型銅綠假單胞菌由香港中文大學(xué)威爾斯親王醫(yī)院惠贈(zèng)。1.1.2微生物試劑和培養(yǎng)基半自動(dòng)MicroScanautoSCAN4型微生物分析儀,NC21,M-H營(yíng)養(yǎng)瓊脂購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司,頭孢他啶紙片(30ug/片)購(gòu)自英國(guó)OXOID公司,Cucl1.1.3pcr擴(kuò)增片段的合成溶菌酶、蛋白酶K、TaqDNA聚合酶購(gòu)自上海生物工程公司,檢測(cè)引物:IMP-1(5’-CTACCGCAGCAGAGTCTTTGC-3’)、IMP-2(5’-GAACAACCAGTTTTGCCTTACC-3’),擴(kuò)增片段594bp,VIM(5’-ATGGTGTTTGGTCGCATATC-3’)、(5’-TGGGCCATTCAGCCAGATC-3’),擴(kuò)增片段為510bp,VIM-2(5’-AAAGTTATGCCGCACTCACC-3’)、(5’-TGCAACTTCATGTTATGCCG-3’),擴(kuò)增片段為865bp,由上海生物工程公司合成,PCR產(chǎn)物測(cè)序委托中和科技發(fā)展有限公司完成。1.2方法1.2.1確定細(xì)菌的類型和藥物敏感性試驗(yàn)以半自動(dòng)MicroScanautoSCAN4型微生物分析儀進(jìn)行。1.2.2金屬-內(nèi)酰胺酶基因檢測(cè)煮沸法提取細(xì)菌總DNA后,用PCR法進(jìn)行擴(kuò)增金屬β-內(nèi)酰胺酶基因,擴(kuò)增產(chǎn)物用電泳方法檢測(cè),總反應(yīng)體系為50ul,25ul中含10～100ngDNA模板,MgCl1.2.3金屬酶抑制根據(jù)NCCLS紙片擴(kuò)散法,將質(zhì)控菌株用生理鹽水將菌株稀釋成101.2.4金屬酶檢測(cè)用生理鹽水將臨床微生物送檢標(biāo)本中耐亞胺培南和(或)頭孢他啶銅綠假單胞菌共100份稀釋成1022.1最佳抑菌效果的酶抑制物篩選用8種酶抑制物檢測(cè)質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922,肺炎克雷伯菌ATCC7006003(產(chǎn)ESBLS菌株),銅綠假單胞菌ATCC27853,產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶VIM-2、IMP-1、IMP-2型銅綠假單胞菌,評(píng)估出最佳抑菌效果的酶抑制物,結(jié)果見表1。從表中可見8種酶抑制物都有不同程度的抑菌作用,其中2-巰基丙酸對(duì)產(chǎn)IMP-1、IMP-2型金屬酶的銅綠假單胞菌抑菌環(huán)大而清晰,且易判斷,抑菌環(huán)直徑增大均值分別為9.2mm、9.0mm,巰基乙醇和巰基乙酸也有較清晰結(jié)果,但比2-巰基丙酸抑菌環(huán)小,比金屬鹽化合物抑菌環(huán)大,EDTA對(duì)產(chǎn)VIM-2型金屬酶銅綠假單胞菌抑菌環(huán)大而清晰,抑菌環(huán)直徑增大均值為8.8mm,二乙烯三胺五乙酸也有較清晰結(jié)果,但比EDTA抑菌環(huán)小,比金屬鹽化合物抑菌環(huán)大。大腸埃希菌ATCC25922,肺炎克雷伯菌ATCC7006003(產(chǎn)ESBLS菌株),銅綠假單胞菌ATCC27853抑菌環(huán)直徑增大均值均小于2.0mm以下。2.2vm型金屬酶檢測(cè)使用引物IMP-1、IMP-2、VIM擴(kuò)增100份耐亞胺培南和(或)頭孢他啶銅綠假單胞菌的金屬酶基因,共檢出IMP-1型金屬酶陽(yáng)性3株,擴(kuò)增出594bp左右條帶,VIM型金屬酶陽(yáng)性6株,擴(kuò)增出510bp左右條帶,與預(yù)計(jì)目的片段長(zhǎng)度相近,將VIM陽(yáng)性株用VIM-2型引物進(jìn)行PCR,結(jié)果亦為陽(yáng)性,擴(kuò)增出850bp左右條帶,克隆測(cè)序的序列與GenBank公布的VIM-2基因序列(AY029772)一致,確認(rèn)為VIM-2型金屬酶。質(zhì)控菌株產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶VIM-2、IMP-1、IMP-2型銅綠假單胞菌金屬酶基因檢測(cè)全部陽(yáng)性,大腸埃希菌ATCC25922,肺炎克雷伯菌ATCC7006003(產(chǎn)ESBLS菌株),銅綠假單胞菌ATCC27853金屬酶基因檢測(cè)全部陰性。2.3微生物金屬酶檢測(cè)用優(yōu)選出來(lái)的酶抑制物乙二胺四乙酸和2-巰基丙酸聯(lián)合檢測(cè)100份耐亞胺培南和(或)頭孢他啶銅綠假單胞菌臨床標(biāo)本,結(jié)果見表2。從表中可見2-巰基丙酸檢測(cè)IMP型金屬酶抑菌環(huán)增大均值為8.8mm(擴(kuò)大范圍為6～12mm),VIM型金屬酶抑菌環(huán)增大均值為5.2mm(擴(kuò)大范圍為2～7mm),用EDTA檢測(cè)IMP型金屬酶抑菌環(huán)增大均值為4.8mm(擴(kuò)大范圍為1～7mm),VIM型金屬酶抑菌環(huán)增大均值為8.4mm(擴(kuò)大范圍為6～12mm),根據(jù)PCR金屬酶陽(yáng)性結(jié)果,將抑菌環(huán)直徑增大為6mm定為金屬酶陽(yáng)性,若單用2-巰基丙酸檢測(cè)金屬酶,有可能漏檢型VIM型金屬酶,或單用EDTA檢測(cè)金屬酶的話,則有可能漏檢IMP型金屬酶,若兩