亞胺的不對稱催化還原制備手性胺的研究進(jìn)展

亞胺的不對稱催化還原制備手性胺的研究進(jìn)展

氨基通常存在于自然界的各種生物活性物質(zhì)中，如堿性（嗎啡、麻黃堿）、蛋白質(zhì)、激素和抗生素。其中,手性胺作為一類極其重要的化合物,不僅可以作為一些藥物合成的中間體和農(nóng)用化學(xué)品的有效成份,也可以作為一些過渡金屬的配體或者直接作為有機(jī)小分子催化劑用于催化手性化合物的合成,同時(shí)還可以用于香料香精產(chǎn)業(yè)然而,隨著制藥工業(yè)對環(huán)境以及行業(yè)規(guī)范要求的日益提高,傳統(tǒng)化學(xué)合成的方法局限性日益凸顯,生物催化的不對稱合成因具有反應(yīng)條件溫和、選擇性高、綠色無污染等優(yōu)點(diǎn),并且隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,對酶的修飾和改性變得更加容易,逐漸被廣泛應(yīng)用于手性胺的合成中。例如ChristopherKS.小組采用高活性的轉(zhuǎn)氨酶突變體催化酮到手性胺的不對稱轉(zhuǎn)化,成功實(shí)現(xiàn)了西格列汀的合成在生物體中也存在亞胺還原的生化反應(yīng)過程,例如:在生物體內(nèi)存在一種“一碳單位”的接納體和供體-葉酸是一種水溶性B族維生素,廣泛存在于綠色植物、蘑菇、酵母、肝臟和腎臟中。以NADPH為輔酶,葉酸(1-a)能在二氫葉酸(DHF)還原酶作用下,經(jīng)兩次連續(xù)還原,先后生成7,8-二氫葉酸(1-b)和5,6,7,8-四氫葉酸(1-c),即輔酶F(見圖1)。此外,在生物體內(nèi)氨基酸代謝的過程中,由谷氨酸脫氫酶(GDH)介導(dǎo)的氨基酸的氮轉(zhuǎn)移過程中可以產(chǎn)生亞胺中間體,然后經(jīng)不對稱還原得到手性α-氨基酸(見圖2)盡管亞胺還原酶催化亞胺的不對稱還原反應(yīng)早有相關(guān)報(bào)道,但由于傳統(tǒng)亞胺化合物在水相體系中差的穩(wěn)定性,易分解生成相應(yīng)的酮和胺,而水相往往又是生物酶催化反應(yīng)的傳統(tǒng)介質(zhì),這無疑限制了亞胺還原酶在催化亞胺不對稱還原反應(yīng)中的應(yīng)用。大多數(shù)亞胺中間體為環(huán)狀酮亞胺,并且與酮之間存在動(dòng)態(tài)平衡,在酶催化作用下,平衡可以向生成新的手性氨的反應(yīng)方向移動(dòng)。因此,可以用醛或酮代替亞胺,在轉(zhuǎn)氨酶催化作用下,實(shí)現(xiàn)手性胺的高對映選擇性合成,從而克服以亞胺作底物在水溶液中不穩(wěn)定的局限性。下面將重點(diǎn)對生物催化亞胺合成手性胺化合物的方法進(jìn)行討論。1放線菌屬微生物的篩選2004年,StephensG.小組以正丁醛、苯甲醛、正丁胺和苯胺作為底物,采用動(dòng)態(tài)組合篩選的方法,以水和正十四烷作為兩相反應(yīng)體系,成功篩選出亞胺還原酶產(chǎn)生菌株Acetobacteriumwoodii。在篩選過程中他們發(fā)現(xiàn),用咖啡酸酯誘導(dǎo)后的菌株在催化N-亞芐基苯胺和N-亞丁基苯胺的還原反應(yīng)中,能夠顯示出高的催化活性;而不經(jīng)誘導(dǎo)的菌株只能用于N-亞丁基苯胺和苯甲醛的還原,對其他底物的還原沒有催化活性(見圖3)2008年,ChadhaA.小組以芳香亞胺為底物,采用CandidaparapsilosisATCC7330整細(xì)胞生物催化劑,實(shí)現(xiàn)了水相體系中亞胺的不對稱還原反應(yīng),獲得了R構(gòu)型的芳香仲胺。研究過程中,他們發(fā)現(xiàn)苯環(huán)上連有吸電子基團(tuán)或供電子基團(tuán)對反應(yīng)結(jié)果影響不大,對映選擇性為95%~99%,產(chǎn)率為55%~80%(見圖4)2010年,MitsukuraK.小組以2-甲基-1-二氫吡咯(2-MPN)為底物,從226株酵母菌、261株細(xì)菌、117株放線菌和84株真菌中篩選獲得了五株具有亞胺還原活性的放線菌屬微生物。用其中一株催化2-MPN的不對稱還原,可以得到S構(gòu)型的產(chǎn)物,而用另外四株催化該反應(yīng),則得到R構(gòu)型的產(chǎn)物。值得注意的是,這些菌株具有較好的底物耐受性,即使在27.5~91mmol/L的底物濃度下,產(chǎn)物的收率和ee值也可分別達(dá)到92%和99.2%(見圖5)隨后,他們克隆表達(dá)了菌株中的亞胺還原酶基因,發(fā)現(xiàn)對R/S選擇性的亞胺還原酶均依賴輔酶NADPH,且均為同源二聚體結(jié)構(gòu),亞基大小分別為32kDa、30.5kDa。更有趣的是,在中性pH條件下,具有R選擇性的還原酶對2-MPN表現(xiàn)出還原活性,在堿性條件下,則對(R)-2-MP表現(xiàn)出氧化活性。此外,通過對兩種不同選擇性的亞胺還原酶進(jìn)行氨基酸序列分析,發(fā)現(xiàn)S選擇性的亞胺還原酶與6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶具有60%的相似度,而R選擇性的亞胺還原酶與6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶的相似度只有37%同年,SantosLS.小組采用Saccharomycesbayanus整細(xì)胞催化的方法,實(shí)現(xiàn)了β-咔啉亞胺類化合物的不對稱還原,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,R取代基對反應(yīng)的選擇性有著很大的影響。當(dāng)R為C2012年,LambA.L.小組從Yersiniaenterocolitica中分離得到依賴NADPH的亞胺還原酶,在噬鐵耶爾森桿菌素形成過程中用于介導(dǎo)二氫噻唑的還原。通過將分離獲得的亞胺還原酶與載脂蛋白及NADP2013年,GrogenG.小組用從Streptomyceskanamyceticus中獲得的氧化還原酶(Q1EQE0),實(shí)現(xiàn)了單環(huán)亞胺2-甲基-1-二氫吡咯啉的不對稱還原反應(yīng)。Q1EQE0的分子量大小為32kDa,在以NADPH作為輔酶的情況下,K2014年,Hue56ehneM.小組分別從類芽孢桿菌PaenibacilluselgiiB69、鏈霉菌Streptomycesipomoeae91-03、假單胞菌PseudomonasputidaKT2440中克隆表達(dá)出三種亞胺還原酶,其中從假單胞菌中克隆獲得的亞胺還原酶顯示出最好的催化活性。進(jìn)一步的基因突變證明該酶起催化作用的殘基為組氨酸殘基,有別于已報(bào)道的克隆于Streptomyceskanamyceticus的還原酶,后者起催化作用的是天冬氨酸殘基(見圖7)同年,HauerB.小組通過將已報(bào)道的亞胺還原酶基因的序列于已獲得的亞胺還原酶序列進(jìn)行比對分析,分別篩選出了具有R選擇性和S選擇性的亞胺還原酶的基因序列。通過進(jìn)一步克隆表達(dá)、蛋白純化獲得了純酶催化劑,并以此催化2-甲基-二氫吡咯的不對稱還原反應(yīng)。研究表明,與之前報(bào)道的亞胺還原酶相比,這些酶可以表現(xiàn)出更好的催化活性,而且活性中心的氨基酸殘基對還原活性的維持起著至關(guān)重要的作用2親和素蛋白的協(xié)同催化除了上述的亞胺還原酶外,人工金屬酶也被廣泛應(yīng)用于亞胺的不對稱還原反應(yīng),這類催化劑主要是利用肽支架與化學(xué)催化劑的中心結(jié)合,以達(dá)到改變反應(yīng)的微環(huán)境的目的,實(shí)現(xiàn)對反應(yīng)選擇性的控制。2011年,WardT.R.小組利用生物素衍生的雙胺配體/金屬配合物與野生型鏈霉親和素蛋白協(xié)同催化6,7-二甲氧基-1-甲基-3,4-二氫異喹啉的不對稱還原反應(yīng),得到了R構(gòu)型的豬毛菜定在前期的工作基礎(chǔ)上,他們通過基因工程技術(shù)對宿主蛋白周圍的基因進(jìn)一步修飾,篩選獲得的氫化酶(ATHase),能夠高效催化6,7-二甲氧基-1-甲基-3,4-二氫異喹啉的不對稱轉(zhuǎn)移氫化反應(yīng),得到不同構(gòu)型的還原產(chǎn)物。進(jìn)一步研究證明,金屬銥和鏈霉親和素蛋白的結(jié)合比例可以在很大程度上影響亞胺還原酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)及其催化反應(yīng)的對映選擇性。通過計(jì)算機(jī)輔助計(jì)算和X射線衍射技術(shù)分析有機(jī)金屬與生物支架的對接情況,并結(jié)合飽和動(dòng)力學(xué)研究,他們提出了高對映選擇性“誘導(dǎo)鎖鑰”假說,即宿主蛋白的結(jié)構(gòu)決定了金屬銥輔因子的組態(tài),該組態(tài)又在很大程度上決定了亞胺還原酶的選擇性。更值得一提的是,人工金屬酶被證明具有野生酶的原始活性,其不僅可以彌補(bǔ)野生酶的不足,還可用于催化串聯(lián)反應(yīng)(見圖8)3不對稱還原制備的光學(xué)純仲胺本文對亞胺還原酶制備手性胺的應(yīng)用研究進(jìn)行了簡要的概述,重點(diǎn)探討