EDU熒光顯微鏡檢測(cè)方法

33Apollo?催化劑溶液（試劑C）5pL10pL50pL100pL熒光顯微鏡檢測(cè)方法（以96孔板，A549貼壁細(xì)胞為例）細(xì)胞培養(yǎng)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔4X103?IX105細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)至正常生長(zhǎng)階段。藥物處理（可選）客戶可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行各種藥物處理。EdU標(biāo)記1?1用細(xì)胞培養(yǎng)基按1000：1的比例稀釋EdU溶液（試劑A）,制備適量50uMEdU培養(yǎng)基；注：1）如果需配置10uMEdU培養(yǎng)基，需調(diào)整為5000：1稀釋比例；2）配置好的培養(yǎng)基的保存時(shí)間取決于培養(yǎng)基的性質(zhì)，如LB培養(yǎng)基4°C可穩(wěn)定保存兩周。每孔加入100?L50uMEdU培養(yǎng)基孵育2小時(shí)，棄培養(yǎng)基；注：1）EdU培養(yǎng)基用量以沒過細(xì)胞為宜（表1）；2）最佳孵育時(shí)間與細(xì)胞周期相關(guān)（表2），大多數(shù)細(xì)胞系可采用2小時(shí)孵育時(shí)間；3）EdU濃度與孵育時(shí)間相關(guān)，短時(shí)間孵育（＜30min）宜采用高濃度（50uM），長(zhǎng)時(shí)間孵育（＞24h）宜采用低濃度（1uM）,最佳孵育濃度需要優(yōu)化。PBS清洗細(xì)胞1~2次，每次5分鐘。注：清洗目的是將未滲入DNA的EdU洗脫，清洗方式依據(jù)不同的細(xì)胞類型而定，貼壁不牢的細(xì)胞請(qǐng)降低清洗強(qiáng)度。細(xì)胞固定化2.1每孔加入100uL細(xì)胞固定液（即含4%多聚甲醛的PBS）室溫孵育30分鐘；注:1）低濃度的多聚甲醛有利于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的保持，當(dāng)需要抗體染色時(shí)，需采用TritonX-100透化細(xì)胞以利于抗體染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。2）可采用其他方式進(jìn)行細(xì)胞固定。每孔加入2mg/mL甘氨酸，脫色搖床孵育5分鐘后，棄甘氨酸溶液；注：作用是中和多聚甲醛，當(dāng)采用其他方式進(jìn)行細(xì)胞固定時(shí)可省略此步驟；2.3每孔加入100uLPBS，脫色搖床清洗5分鐘，棄PBS；（加強(qiáng)）每孔加入100uL滲透劑（0.5%TritonX-100的PBS）脫色搖床孵育10分鐘；PBS清洗1次，5分鐘。注：當(dāng)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行其他抗體染色，或由于某些細(xì)胞類型對(duì)染料的吸附性較高，可能需要增強(qiáng)細(xì)胞膜通透性。Apollo染色3?1每孔加入100uL的1XApollo?染色反應(yīng)液（表3），避光、室溫、脫色搖床孵育30分鐘后，棄染色反應(yīng)液；注：染色液用量與細(xì)胞培養(yǎng)體積相關(guān)，以覆蓋細(xì)胞為宜（表1）。加入100uL滲透劑（0.5%TritonX-100的PBS）脫色搖床清洗2~3次,每次10分鐘，棄滲透劑；（加強(qiáng)）每孔每次加入100uL甲醇清洗1~2次，每次5分鐘；PBS清洗1次，每次5分鐘。注：由于某些細(xì)胞對(duì)染料的吸附性較高，需采用加強(qiáng)方式洗脫以降低染料背景。DNA染色4?1用去離子水按100：1的比例稀釋試劑F，制備適量1XHoechst33342反應(yīng)液，避光保存；

每孔加入100uL1XHoechst33342反應(yīng)液，避光、室溫、脫色搖床孵育30分鐘后,棄染色反應(yīng)液；每孔每次加入100uLPBS清洗1~3次；客戶可選擇進(jìn)行其他染色步驟，否則每孔加入100uLPBS保存待用。其他染色（自備）（可選）客戶可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)抗原的抗體染色（注：染料兼容性請(qǐng)參照表4）。圖像獲取及分析染色完成后，建議立即進(jìn)行觀測(cè)；如果條件限制，請(qǐng)避光4°C濕潤(rùn)保存待測(cè)，但不應(yīng)超過3天。注：調(diào)試儀器時(shí)，請(qǐng)將曝光時(shí)間調(diào)整為30ms左右，盡量不要＞ls。提示：預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果請(qǐng)發(fā)回銳博生物分析。表1EdU培養(yǎng)基及染色反應(yīng)液的使用量參考2mL表1EdU培養(yǎng)基及染色反應(yīng)液的使用量參考2mL孔EdU培養(yǎng)基100pl150pl200pl300pl500pl染色反應(yīng)液100pl150pl200pl300pl500pl2mL注：1）*表示貼壁細(xì)胞通常采用的培養(yǎng)容器，EdU培養(yǎng)基與染色反應(yīng)液用量以覆蓋細(xì)胞為宜；2）懸浮細(xì)胞EdU用量請(qǐng)按培養(yǎng)體積而定?！猒EdU1孵育時(shí)間取決于細(xì)1胞生長(zhǎng)速度1HekaHEK293*細(xì)胞系人胚胎細(xì)胞酵母細(xì)胞人成纖維細(xì)胞人宮頸癌細(xì)胞人胚腎細(xì)胞系人神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞周期~30min~3h~18h~21h?25h~5d孵育時(shí)間5min20min2h2h2h1d注：1）EdU孵育時(shí)間取決于細(xì)胞周期，一般為細(xì)胞周期的1/10至1/5；2）*考慮到細(xì)胞培養(yǎng)基、溫度、濕度、光線等其他因素的影響，細(xì)胞周期會(huì)有所變化，但大多數(shù)細(xì)胞系可采用?h孵育時(shí)間。配制順序去離子水表3染色反應(yīng)液的配置（現(xiàn)田現(xiàn)配）500“L*469pL1mL5mL10mL938pL4.69mL9.38mLApollo?配制順序去離子水表3染色反應(yīng)液的配置（現(xiàn)田現(xiàn)配）500“L*469pL1mL5mL10mL938pL4.69mL9.38mLApollo?反應(yīng)緩沖液（試劑B）25pL50pL250pL500pL4Apollo?熒光染料溶液（試劑D）1.5pL3pL15pL30pL5Apollo?緩沖添加劑（試劑E）5mg9mg44mg88mg注：1）*表示通常配制的Apollo?反應(yīng)液的體積;2）按順序配制適量IXApollo?染色反應(yīng)液，以免破壞正常的反應(yīng)體系（現(xiàn)用現(xiàn)配，30分鐘用完）;3）試劑E為白色粉末，較易氧化，使用后請(qǐng)旋緊管蓋，如試劑出現(xiàn)棕黃色，則需更換。粉末較難