間接免疫熒光試驗(yàn)課件

間接熒光免疫實(shí)驗(yàn)

2013307341葉蘋蘋

間接熒光免疫實(shí)驗(yàn)

20133073411一、原理根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。一、原理根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒2二、常見熒光素特性1)FITC：黃色結(jié)晶粉末，吸收光：490~495nm，發(fā)射光：520~530nm，明亮的黃綠色熒光。2)RB200：橘紅色粉末，吸收光570nm，發(fā)射光595~600nm，橘紅色熒光。3)TRITC：紫紅色粉末，吸收550nm，發(fā)射光620nm，橙紅色熒光。4）鑭系：Eu、Tb5)PE：吸收光490~560nm，發(fā)射光595nm，紅色熒光。6）其它：酶作用后產(chǎn)生熒光物質(zhì)。二、常見熒光素特性1)FITC：黃色結(jié)晶粉末，吸收光：4903三、分類直接免疫熒光法間接免疫熒光法三、分類直接免疫熒光法4四、應(yīng)用將病毒接到敏感細(xì)胞上進(jìn)行增殖復(fù)制，待病價(jià)最高的時(shí)候進(jìn)行間接熒光免疫實(shí)驗(yàn)用于分毒時(shí)，確定有無病毒的存在測(cè)抗體四、應(yīng)用將病毒接到敏感細(xì)胞上進(jìn)行增殖復(fù)制，待病價(jià)最高的時(shí)候進(jìn)5五、優(yōu)缺點(diǎn)及注意事項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)：特異性高、敏感性高、速度快缺點(diǎn)：非特異性染色注意事項(xiàng)：1、每次試驗(yàn)應(yīng)設(shè)陽性和陰性對(duì)照2、應(yīng)注意熒光抗體的質(zhì)量3、標(biāo)本應(yīng)避光保存五、優(yōu)缺點(diǎn)及注意事項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)：特異性高、敏感性高、速度快6六、操作步驟1、病毒吸附：5%cpv同步接毒，3d2、丙酮固定：80%丙酮，4℃,1h3、洗滌：用PBS洗滌3遍∕3min4、加入一抗：加入抗CPV陽性血清（1：100倍稀釋），200μL/孔，37℃濕盒中作用3h5、洗滌6、加入二抗：加入FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗（1:300倍稀釋）50μL，37℃閉光作用1h；7、洗滌8、鏡檢：熒光顯微鏡觀察，拍照，有綠色熒光者判為陽性，無熒光