經(jīng)典名方保元湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑uplc特征圖譜及多指標(biāo)成分含量測定

經(jīng)典名方保元湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑uplc特征圖譜及多指標(biāo)成分含量測定

寶元湯是一種著名的傳統(tǒng)中醫(yī)方劑，起源于明代孫志宏的經(jīng)典《醫(yī)學(xué)同益》。它由人參、黃原、甘草、肉桂和姜組成。姜的一部分是在水中煮的。它對補(bǔ)充活力也很有效。近年來，為了迅速適應(yīng)國家藥品的市場需求和促進(jìn)中草藥復(fù)方制劑的快速發(fā)展，國家大力鼓勵經(jīng)典名方的開發(fā)，對出自古代經(jīng)典名方中的中藥復(fù)方制劑采用簡化審核的管理規(guī)定目前，針對經(jīng)典名方保元湯的報道多集中于其臨床相關(guān)應(yīng)用，鮮有關(guān)于建立保元湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜同時進(jìn)行含量測定的研究報道。經(jīng)典名方保元湯作為本實驗的研究對象，其15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑是參照明孫志宏《簡明醫(yī)彀》“煎丸服法”中對煎煮的相關(guān)記載進(jìn)行制備，建立了BYD標(biāo)準(zhǔn)湯劑的UPLC特征圖譜，并結(jié)合層次聚類分析（Hierarchicalclusteranalysis,HCA）和主成分分析（Principalcomponentanalysis,PCA）的化學(xué)模式識別方法篩選差異較大成分，同時對指標(biāo)成分人參皂苷Rb1、甘草酸進(jìn)行含量測定，確定轉(zhuǎn)移率、出膏率范圍。這些方法為經(jīng)典名方保元湯的質(zhì)量控制提供和依據(jù)。1藥品、藥材與藥材本研究所使用儀器見表1。人參皂苷Rb1（中國食品藥品檢定研究院，批號為110704-201827，純度為91.2%），甘草酸單銨鹽（上海源葉生物科技有限公司，批號為P13A9L67602，純度為≥98%）。本研究中所使用的水為娃哈哈純凈水，所用甲醇和乙腈是色譜純，其他試劑純度為分析純。勁牌持正堂藥業(yè)有限公司提供本研究所使用的藥材，本方中所黃芪和甘草均為多基原藥材，經(jīng)DNA條形碼鑒定，本方所用黃芪均為蒙古黃芪，甘草均為烏拉爾甘草。各批次藥材產(chǎn)地信息和15批保元湯組方配伍信息詳見表2。2方法2.1寶元湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究2.1.1對照溶液的制備精密稱定適量人參皂苷Rb1、甘草酸單銨鹽對照品，置于容量瓶中，加甲醇配置對照品溶液，使其濃度分別為1.1mg·mL2.1.2保元湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備根據(jù)《簡明醫(yī)彀》原文及劑量折算，取人參3.73g、黃芪7.46g、甘草1.86g、肉桂0.75g、生姜1片（3g），混合均勻，置于燒杯中浸泡35min后加水至兩鍾（600mL）后倒入煎藥壺中，并將其放置于加熱盤上，500W加熱至沸騰，待沸騰穩(wěn)定后調(diào)至300W使其保持微沸至藥液八分（240mL），使用8號篩過濾藥液。藥渣再加水鍾半（450mL）后500W加熱使其沸騰，300W使其保持微沸至藥液七分（210mL），使用8號篩過濾藥液，兩次藥液晾涼后合并混勻得450mL保元湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑。15批BYD標(biāo)準(zhǔn)湯劑均按此制備，將其編號為BYD01-BYD15。精密取0.8mL保元湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑和0.8mL甲醇至同一離心管中，渦旋混勻，離心（14000r·min2.1.3洗脫反應(yīng)1.5minACQUITYBEHShiedC18column(2.1×100mm,1.7μm）色譜柱，流動相0.01%甲酸水（A)-0.05%甲酸乙腈（B）梯度洗脫（0min-0.5min,5-19%B;0.5min-6min,19%B;6min-10min,19-27%B;10min-20min,27-45%B;20min-20.1min,45-95%B;20.1min-23min,95%B;23min-23.1min,95-5%B;23.1min-26min,5%B），柱溫30℃，流速0.4mL·min2.1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備(1）線性關(guān)系考察精密吸取0.02、0.1、0.15、0.3、0.4mL“2.1.1”項下配置好的人參皂苷Rb1對照品溶液放置在5mL容量瓶中，加甲醇定容。人參皂苷Rb1在203nm下的峰面積使用“2.1.3”項下的色譜條件測定，并以此為縱坐標(biāo)（Y），人參皂苷Rb1進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)（X）計算回歸方程。精密吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL“2.1.1”項下配置好的甘草酸銨對照品溶液放置在5mL容量瓶中，加甲醇定容。甘草酸在203nm下的峰面積使用“2.1.3”項下的色譜條件測定，并以此為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)（X）計算回歸方程。(2）精密度和穩(wěn)定性考察根據(jù)“2.1.3”項下的色譜條件測定同一批BYD供試品溶液6次進(jìn)樣中人參皂苷Rb1和甘草酸的峰面積，并計算RSD值。根據(jù)“2.1.2”項下的方法制備1批BYD供試品溶液，分別于制備后、2h、4h、8h、12h、24h后按照“2.1.3”項下色譜條件進(jìn)樣，測定人參皂苷Rb1和甘草酸的峰面積，并計算RSD值。(3）重復(fù)性考察根據(jù)“2.1.2”項下方法平行制備同一批次BYD的6批供試品溶液后，按照“2.1.3”項下色譜條件進(jìn)樣，測定其中人參皂苷Rb1和甘草酸的峰面積，并計算RSD值。(4）回收率考察精密吸取BYD標(biāo)準(zhǔn)湯劑（S05)0.8mL，加入與其濃度相同人參皂苷Rb1對照品溶液0.8mL渦旋混勻后，14000r·min2.1.5特征圖譜相似度評價(1）精密度考察將1份BYD供試品溶液按“2.1.3”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次的色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”軟件（2012版），進(jìn)行峰匹配，計算特征圖譜相似度。(2）穩(wěn)定性考察將1份BYD供試品溶液于制備后、2h、4h、8h、12h、24h后按照“2.1.3”項下色譜條件進(jìn)樣的色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”軟件（2012版），進(jìn)行峰匹配，計算特征圖譜相似度。(3）重復(fù)性考察將平行制備同一批次BYD的6批供試品溶液按照“2.1.3”項下色譜條件進(jìn)樣的色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”軟件（2012版），進(jìn)行峰匹配，計算特征圖譜相似度。2.1.6主成分分析法HCA是一種多元分析方法，它將樣本分為若干類，以確定樣本之間的關(guān)聯(lián)程度。每個樣本之間的相似性或差異性通常用直觀易懂的樹形圖來表示。PCA是一種廣泛應(yīng)用于處理多元問題的分析方法。采用主成分分析法對原始數(shù)據(jù)集進(jìn)行降維，在不損失太多信息的前提下，用較少的潛在因素解釋大量自變量之間的相關(guān)性。本研究以15批保元湯21個共有峰的峰面積為變量，構(gòu)建21×15的原始數(shù)據(jù)矩陣，用SIMCA14.1軟件進(jìn)行HCA和PCA分析，在進(jìn)行HCA分析時，以Word法作為融合規(guī)則，大小為度量建立聚類。2.2寶元湯與實物冷凍表面的對應(yīng)關(guān)系研究2.2.1對應(yīng)實物及凍干粉的制備15批BYD標(biāo)準(zhǔn)湯劑每批各取100mL放在冷凍真空干燥機(jī)的凍干盤中，使其在冷阱中冷凍6h左右后，抽真空36h左右使其全部干燥后所得粉末即為對應(yīng)實物凍干粉，將其編號01-15，其編號與標(biāo)準(zhǔn)湯劑編號相對應(yīng)。每批BYD標(biāo)準(zhǔn)湯劑分別精密量取2.5mL于羅口瓶中，將其制備為凍干粉后加50%甲醇適量溶解，將溶液完全轉(zhuǎn)移至5mL容量瓶中，超聲30min冷卻至室溫后加50%甲醇定容，搖勻。使用0.22μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得BYD對應(yīng)實物供試品溶液。2.2.2相應(yīng)的實物含量測量按照“2.1.3”項下色譜條件測定，BYD對應(yīng)實物供試品溶液中人參皂苷Rb1、甘草酸的峰面積并計算其含量。3結(jié)果3.1研究方法的結(jié)果3.1.1線性關(guān)系研究人參皂苷Rb1回歸方程為Y=3533.8X-4029.5,r=0.9998，線性范圍為4.38-87.55μg·mL3.1.2儀器精密度試驗精密度結(jié)果顯示人參皂苷Rb1、甘草酸峰面積RSD值分別為0.84%、0.29%，表明儀器精密度良好。穩(wěn)定性結(jié)果顯示人參皂苷Rb1、甘草酸峰面積RSD值分別為4.59%、0.66%，表明BYD供試品溶液在24h時內(nèi)穩(wěn)定性良好。3.1.3重復(fù)試驗重復(fù)性結(jié)果顯示人參皂苷Rb1、甘草酸在BYD標(biāo)準(zhǔn)湯劑中濃度的RSD值分別為2.46%、1.70%，表明本方法重復(fù)性良好。3.1.4返回率研究人參皂苷Rb1、甘草酸平均加樣回收率分別為103.00%、99.96%,RSD值依次為1.51%、0.58%，該方法準(zhǔn)確度良好。3.2湯劑的標(biāo)準(zhǔn)研究3.2.1人參皂苷rb1、甘草酸峰面積的測定精密吸取“2.1.2”項下BYD標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液，按照“2.1.3”項下色譜條件測定人參皂苷Rb1、甘草酸峰面積并計算其含量。結(jié)果見表3。人參皂苷Rb1的平均含量為22.49μg?mL3.2.2重復(fù)性結(jié)果分析(1）特征圖譜方法學(xué)考察結(jié)果特征圖譜方法的精密度結(jié)果大于0.97，表明該方法精密度良好；穩(wěn)定性結(jié)果大于0.97，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定；重復(fù)性結(jié)果大于0.9，表明該方法的重復(fù)性良好。(2）標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜研究結(jié)果將“2.1.5”項下所得到的BYD標(biāo)準(zhǔn)湯劑色譜圖導(dǎo)入軟件“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012版）進(jìn)行分析，參照圖譜選擇S01，進(jìn)行峰匹配后利用軟件中“生成對照”選項生成對照圖譜（圖1）。結(jié)果顯示203nm下共有峰21個，指認(rèn)6個。203nm下15批BYD標(biāo)準(zhǔn)湯劑之間的相似度均大于0.85，與對照特征圖譜的相似度均大于0.9，符合特征圖譜相似度要求（表4）。3.2.3保元湯不同批量的聚類聚類檢測層次聚類的樹形圖如圖2(a）所示，顯示了兩個聚類。聚類Ⅰ又分為兩組，第1組（S01、S08、S10）和第2組（S02、S04、S07）。聚類II又分為第3組和第4組。第3組包括S06、S13和S14；第4組包括S03、S05、S09、S11、S12和S15。HCA的結(jié)果并未直接顯示與各味藥材產(chǎn)地的相關(guān)性，表明本次實驗中使用的保元湯每種飲片15個批次配對良好，整體質(zhì)量均一。由圖2(a）與（b）可以看出，HCA第二組的排列順序與PCA第一象限相同，HCA聚類Ⅰ分布在兩個不同的象限，表明HCA結(jié)果與PCA結(jié)果高度一致。PCA的結(jié)果與相似度的結(jié)果也可相互對應(yīng)，BYD10與BYD02、BYD04、BYD07之間的相似度未達(dá)到0.9，在PCA的圖中雖均在右象限中，但位于上下兩個不同的象限；BYD13與BYD02、BYD04、BYD07位于兩個不同的象限之中，他們之間的相似度也未達(dá)到0.9。21個共有峰的載荷散點圖顯示了每個變量對PCA模型的貢獻(xiàn)，由圖2(c）可以看出P04（峰04,Peak04）、P02、P03、P11、P14、P06、和P07對PCA模型有較大的影響，說明這7個成分可能是15批保元湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑的差異性質(zhì)量標(biāo)志物，通過對照品比對可知P04為毛蕊異黃酮葡萄糖苷，P11為人參皂苷Rg1,P06為甘草苷。3.2.4平均出膏率及冷凍干燥率出膏率的計算按照公式（1）進(jìn)行，結(jié)果見表3。保元湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率為28.36%-33.69%，平均出膏率為31.62%，未出現(xiàn)離散數(shù)據(jù)（平均值的70%-130%），說明對應(yīng)實物凍干粉的得率穩(wěn)定，并且冷凍干燥法所得到的粉末質(zhì)地均勻，沒有結(jié)塊，易于儲存，可作為后續(xù)復(fù)方制劑制備的穩(wěn)定原料。注：m：凍干粉質(zhì)量，V：物質(zhì)基準(zhǔn)體積，v：物質(zhì)基準(zhǔn)取樣體積，M：飲片質(zhì)量3.3寶元湯與物理含量的測定含量測定與轉(zhuǎn)移率結(jié)果見表5。保元湯對應(yīng)實物中人參皂苷Rb1的平均含量為1.68mg?g4討論4.1基于劑量與關(guān)系關(guān)于考察的理論模型中藥方劑講究君臣佐使的配伍關(guān)系，通過藥物之間功效的協(xié)同、制約等來達(dá)到治療的目的，科學(xué)的劑量配比對于藥物達(dá)到上述的配合作用起了至關(guān)重要的作用。劑量同時也是古代醫(yī)家治療理念的綜合體現(xiàn)，是經(jīng)典名方研究中的關(guān)鍵問題。在本方的考證中充分考證原方出處，尊重度量衡考證結(jié)果，明確了劑量折算關(guān)系。丘光明等在《中國科學(xué)技術(shù)史·度量衡卷》中所考證結(jié)論為明清時期1斤約合今596.8g,1兩為37.3g,1錢為3.73g4.2指標(biāo)成分的選擇保元湯以人參為君藥，其中人參皂苷Rg1與人參皂苷Re在標(biāo)準(zhǔn)湯劑色譜圖中分離效果較差且峰面積較小，不做指標(biāo)成分考慮；人參皂苷Rb1在標(biāo)湯中色譜圖中峰型較好且分離度較好，因此選擇人參皂苷Rb1作為指標(biāo)成分。甘草對BYD整體色譜圖的貢獻(xiàn)較大，但由于甘草苷分離度不好，甘草酸峰型及分離度較好，因此選擇甘草酸作為指標(biāo)成分。肉桂與生姜為佐使藥，且主要成分為揮發(fā)性成分，在湯劑的制備過程中容易揮發(fā)，難以控制其含量，不做指標(biāo)成分考慮。綜上，在本方的研究過程中選擇人參皂苷Rb1、甘草酸作為定量分析指標(biāo)成分，可以更加全面地體現(xiàn)物質(zhì)在藥材-飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑-對應(yīng)實物中的傳遞規(guī)律。4.3測定保元湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量本研究建立的保元湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑UPLC特征圖譜操作簡便，重復(fù)性好，為保元湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量評價提供了實驗依據(jù)。通過建立的UPLC特征圖譜進(jìn)行相似度分析可知，15批保元湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜與對照圖譜間的相似度均大于0.9，具有較高的相似性。采用特征圖譜結(jié)合化學(xué)識別模式，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地不同批次的保元湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量存在差異，結(jié)合HCA和PCA，篩選得到P04（毛蕊異黃酮葡萄糖苷）、P02、P03、P11（人參皂苷Rg1）、P14、P06（甘草苷）和P07對不同產(chǎn)地保元湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑分類貢獻(xiàn)較大。后續(xù)可結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，對未知的4個色譜峰成分進(jìn)行定性分析，確認(rèn)其歸屬，挖掘藥材與標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量之間的關(guān)系，以便更準(zhǔn)確全面地控制保元湯的質(zhì)量。同時利用該特征圖譜方法測定了指標(biāo)成分人參皂苷Rb1、甘草酸在保元湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑和對應(yīng)實物中的含量，從定量角度充分體現(xiàn)其傳遞規(guī)律。15批保元湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑中人參皂苷Rb1、甘草酸的質(zhì)量濃度分別為12.62-30.33μg·mL保元湯中指