cscl12及其受體xcr4在佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠脾胃論中的表達(dá)及芍藥苷-6-o-苯磺酸酯對(duì)其的影響

cscl12及其受體xcr4在佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠脾胃論中的表達(dá)及芍藥苷-6'-o-苯磺酸酯對(duì)其的影響

-六和合金牡丹糖（cp-25）是研究團(tuán)隊(duì)對(duì)牡丹總糖（tpm）結(jié)構(gòu)的主要活性物質(zhì)（paeoniflavone，pae）的有效組成。研究表明,TGP和Pae均具有抗炎免疫調(diào)節(jié)作用,可明顯抑制關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)腫脹,改善關(guān)節(jié)、脾臟和腸系膜淋巴結(jié)病理變化。然而,Pae生物利用度低,導(dǎo)致其起效慢。課題組前期研究表明,CP-25(25、50、100mg·kg本研究在前期研究的基礎(chǔ)上,成功建立AA模型,采用CP-25的有效濃度(50mg·kg1材料和方法1.1材料表面1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:scxkSprague-Dawley(SD)大鼠,♂,體質(zhì)量(180±20)g,清潔級(jí),購(gòu)于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(皖)2011-002。1.1.2elisa試驗(yàn)CP-25由本所藥化室提供,白色結(jié)晶狀粉末,純度大于98%;卡介苗(BacillusCalmette-Guerin,BCG)購(gòu)自北京生物制品所;CX-CL12ELISA試劑盒購(gòu)于武漢華美公司;CXCL12、CXCR4抗體購(gòu)于Abcam公司;ECL發(fā)光顯色試劑盒購(gòu)于ThermoScientific公司。1.1.3熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)Olympus顯微成像系統(tǒng);ImageQuantLAS4000熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)GE公司);BioTekElx×808酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司);RM2135石蠟切片機(jī)(德國(guó)萊卡)。1.2方法1.2.1模型a的構(gòu)建將80℃水浴滅活1h的BCG與高壓滅菌的石蠟充分研磨混勻,制成10g·L1.2.2臨床表現(xiàn)與病理分析造模后d28,分別將正常對(duì)照組、模型組、CP-25組和MTX組大鼠放血處死,迅速剪開(kāi)大鼠腹部,分離、留取脾組織,剪取部分脾組織置于4%甲醛溶液中固定,不同濃度梯度乙醇逐級(jí)脫水,石蠟包埋,制作病理切片(厚約5μm),經(jīng)HE染色后,觀察脾臟組織病理改變,進(jìn)行病理評(píng)分。脾臟病理從動(dòng)脈周圍淋巴鞘(periarteriolarlymphoidsheath,PALS)的細(xì)胞密度、淋巴小結(jié)(lymphoidnodule,LN)增生進(jìn)行判定,按照病變從輕到重,進(jìn)行0~3級(jí)病理評(píng)分。PALS細(xì)胞密度評(píng)分:0=正常;1=細(xì)胞密度輕微增大;2=細(xì)胞密度中度增大,有細(xì)胞擁擠;3=細(xì)胞密度重度增大,有細(xì)胞疊加。LN增生評(píng)分:0=正常;1=輕微增生,可見(jiàn)生發(fā)中心;2=中度增生,生發(fā)中心明顯;3=過(guò)度增生,生發(fā)中心多見(jiàn)。1.2.3顯色劑顯色后封片脾臟組織制作病理切片后,經(jīng)脫蠟水化,細(xì)胞通透,抗原修復(fù),稀釋相應(yīng)比例的CXCL12和CXCR4的一抗,4℃過(guò)夜,二抗孵育,顯色劑顯色后封片。采集400倍視野圖像,利用Image-ProPlus分別對(duì)各切片中免疫組化染色陽(yáng)性表達(dá)進(jìn)行半定量分析,測(cè)定脾臟組織中CXCL12和CXCR4蛋白染色平均光密度(meanopticaldensity,MOD)值后,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。1.2.4sds-/pvdf電泳剪取部分脾組織,常規(guī)裂解(RIPA∶PMSF=99∶1)充分研磨后,Lowry法蛋白定量,加蛋白上樣緩沖液,沸水煮8min,取15μL蛋白樣品上樣,進(jìn)行SDS電泳,轉(zhuǎn)至PVDF膜上,脫脂奶粉/TPBS封閉2h,放入稀釋相應(yīng)比例的CXCR4一抗,4℃過(guò)夜,加入稀釋的二抗,室溫孵育2h。ECL試劑盒顯影。結(jié)果采用凝膠成像系統(tǒng)掃描后,以特異性條帶濃度與面積的乘積為有效值,反映蛋白表達(dá)水平。1.2.5esi對(duì)脾組織的檢測(cè)剪取各組大鼠脾組織0.15g,分別加PBS100μL,充分研磨后,離心取上清,用ELISA試劑盒測(cè)CXCL12的表達(dá)。1.3方差分析方法數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS16.0軟件處理,計(jì)量資料以u(píng)e0af±s表示,各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(One-wayANOVA),組間比較采用SNK檢驗(yàn)。脾臟病理評(píng)分與CXCL12/CXCR4的相關(guān)性分析采用Pearson積矩相關(guān)系數(shù)。2結(jié)果2.1紅髓與白髓界限Fig1HE染色結(jié)果顯示,正常對(duì)照組大鼠脾臟結(jié)構(gòu)清晰,紅髓與白髓界限較明顯;與正常對(duì)照組相比,AA組大鼠紅髓與白髓界限模糊,紅髓充血,白髓增生,PALS的細(xì)胞密度增加,LN增多,CP-25可以減少PALS的細(xì)胞密度,改善LN增生。2.2cp-25對(duì)aa大鼠脾臟cxcl12表達(dá)的影響ELISA結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,AA組大鼠脾臟中CXCL12的表達(dá)明顯升高(P<0.05);與AA組相比,CP-25組和MTX組中CXCL12表達(dá)下降(P<0.05)(Fig2A)。免疫組化結(jié)果顯示,各組脾臟淋巴細(xì)胞胞質(zhì)均呈免疫陽(yáng)性反應(yīng);與正常對(duì)照組比較,AA組大鼠脾臟中CXCL12表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05);與AA組比較,CP-25組和MTX組中CXCL12表達(dá)減弱(P<0.05)(Fig2B~2F)。2.3各組大鼠脾臟cxcr4表達(dá)水平比較Westernblot結(jié)果顯示,AA大鼠脾臟中CXCR4表達(dá)較正常對(duì)照組增加(P<0.01),CP-25和MTX可以降低脾臟中CXCR4的表達(dá)(P<0.05)(Fig3A)。免疫組化結(jié)果顯示,各組脾臟淋巴細(xì)胞胞質(zhì)均呈免疫陽(yáng)性反應(yīng);與正常對(duì)照組比較,AA組大鼠脾臟中CXCR4表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05);與AA組比較,CP-25組和MTX組中CXCR4表達(dá)減弱(P<0.05)(Fig3B~3F)。2.4理評(píng)分與cxcl12和cxcr4表達(dá)的關(guān)系相關(guān)性分析結(jié)果顯示,脾臟組織的PALS和LN增生的病理評(píng)分與脾臟組織中CXCL12和CXCR4的表達(dá)之間均存在正相關(guān)(Fig4)。CP-25改善脾臟病理改變可能與下調(diào)脾臟中CXCL12/CXCR4的表達(dá)有關(guān)。3pae的調(diào)節(jié)作用AA模型是一種T細(xì)胞依賴的免疫性炎癥動(dòng)物模型,在臨床表現(xiàn)和病理機(jī)制等方面與RA有許多相似特征,是研究RA病理機(jī)制的較理想動(dòng)物模型CXCL12屬于趨化因子家族,又稱為基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromalcell-derivedfactor-1,SDF-1),具有多種生物功能,如干細(xì)胞動(dòng)員、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和血管生成,參與各種疾病過(guò)程,如癌癥、艾滋病、自身免疫性疾病和缺血性疾病等CP-25是課題組對(duì)TGP的主要有效成分Pae進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,合成的新型活性單體。研究表明,Pae能明顯抑制CIA大鼠B淋巴細(xì)胞增殖,降低血清中IgA、IgG和IgM水平