LI-COROdyssey紅外熒光掃描成像

Odyssey學高分子物質〔膜、膠、微孔塑料板等〕也會發(fā)出熒光，因此易產(chǎn)生高背景的熒LI-COROdyssey承受22680nm780nm2720nm820nm的放射熒光，因而OdysseyIRDyes染料的熒光信號。IRDyes染料的最大吸取值與Odyssey680nm780nm激發(fā)波長相匹配，其放射光波長又與OdysseyIRDye700IRDye800100nm，因此Odyssey可以給出最大的靈敏度和最小的信號穿插。同時由于承受二極管激光器和固態(tài)檢測器，Odyssey具有很長的使用壽命〔4-6萬小時，而系統(tǒng)維護的要求卻很低。該In-Cell-Western分析等蛋白領域爭論。主要特點X廢料產(chǎn)生。3．雙色檢測，可以在一次雜交中同時檢測兩種目的分子，直觀，省時。寬廣的線性范圍，可用于高準確性定量。背景低，圖像清楚，激光強度可調，不會喪失弱的信號強有力的軟件支持，結果分析如確定分子量和定量及圖象處理編輯很簡潔系統(tǒng)操作和維護簡潔Odyssey的應用應用領域：蛋白質爭論，核酸爭論分析，考馬司亮蘭膠的掃描，蛋白雙向電泳，雙色EMSA，雙色微孔板分析，BDPowerBlotAnalysis，NorthernBlot，SouthernBlot等二．系統(tǒng)安裝條件位置要求：穩(wěn)定水平的操作平臺放置設備，遠離熱源，避開陽光直射空間及載重要求：操作平臺尺寸〔長×寬×高操作平臺載重：40kg3.：15-25℃4.濕度要求：不超過60%5.：90-250VAC，47-63Hz。6.其它：通用插頭接線板〔3〕`三．培訓所需試劑設備及樣品WesternBlot：western細胞裂解液電泳緩沖液轉移緩沖液PBSTBSTween-20一抗錫箔紙〔通用試劑具體配方請參照《分子克隆試驗指南〕其它配套設備：蛋白電泳儀脫色搖床轉膜儀分子生物學試驗室常用工具：加樣器，Tip頭，量筒，離心管，離心機，冰盒等。作。四、培訓程序準時間安排〔請至少安排2〕儀器安裝及使用培訓〔2小時〕試驗安排布置，用戶實際操作培訓〔不同的試驗時間有所不同，以WesternBlot1天半光檢測的比照試驗，便利兩種方法結果的比照。軟件根本功能綜述及使用培訓〔1小時〕五、儀器及試劑系統(tǒng)介紹Odyssey紅外成像系統(tǒng)技術特點講解儀器系統(tǒng)組成和工作原理講解配套試劑介紹試驗設計：化學發(fā)光及熒光檢測比照試驗4marker未稀釋樣品，1：10，1：100，1：1000，預染marker，未稀釋樣品，1：10，1：100，1：1000〔兩組樣品中間建議空一個樣品孔，便利以后的剪膜〕轉膜完成后，開頭進展封閉及一抗孵育的操作步驟學發(fā)光檢測的方式進展二抗的孵育，洗脫及結果的分析。Western的試驗流程可Western試驗室的方法。熒光檢測Western操作流程〔以硝酸纖維素膜為例：吸去培育液，用預冷的PBS洗細胞兩次參加細胞裂解液，420min1.5ml離心管，13000rpm，4℃，20min取上清蛋白進展電泳硝酸纖維素膜于轉移緩沖液〔PBS〕20min〔PVDF膜，請先20min〕20min。裁兩張與膠同樣大小的濾紙,置轉移緩沖液中平衡。30min。1～3hour。注：封閉液可以用5的進口脫脂奶粉〔用PBS溶解，由于Tween-20和BSAOdyssey造成高背景，所以在封閉完成前盡量不要讓膜接觸到這兩種物質，所以麻煩您確定封閉液中沒有Tween-20BSA成分?！?1000－150001hour或者4℃過夜。注：抗體的稀釋倍數(shù)與抗體質量和試驗中的蛋白樣本相關，麻煩您依據(jù)閱歷選擇適宜稀0.1-0.2%的Tween-20來降低背景，您可以依據(jù)您要檢測的蛋白以及尋常操作閱歷來選擇需否在一抗稀釋液。PBST4×5mins?！?3000~100001hour〔避光。0.1-0.2%Tween-20Tween-20。Tween-200.01-0.02%SDS于二抗稀釋液中可以比較好的降低背景洗膜同13〔避光〕PBSTween-20，接下來可直接進展掃描。試驗的具體的操作流程、留意事項、問題解決請參見附件以及《分子克隆試驗。儀器的操作流程：在面板上翻開儀器電源開關，再開啟電腦，關機時相反。用軟布或無塵紙蘸雙蒸水將掃描平面的玻璃擦拭干凈。將要掃描的膠或膜放到掃描平面上，登記坐標，扣上艙蓋。雙擊軟件圖標，輸入用戶名、密碼，進入主菜單。點擊scan開頭掃描。掃描完畢后對掃描結果進展分析。依次進展圖象裁切、定道、定分子量標準、背景扣除等操作。依據(jù)需要輸出圖形或數(shù)據(jù)報告表格。速把握如何使用軟件進展掃描。關于進一步的如何使用軟件對試驗結果進展分析，請參見隨機所帶的英文原版使用手冊。掃描操作流程中添加內容，則點擊“Fil”欄中的“Ope〕在窗口“NewProject”中設定工程文件存儲的路徑和工程名稱在登陸窗口輸入用戶名和密碼在“Name”欄輸入該次掃描的名稱在“Group”欄選擇用戶所屬的組在“Preset”欄選擇目前進展掃描的介質〔eg：膜還是膠？〕選擇適宜的區(qū)分率，掃描質量和焦距〔對于膜來說，一般選擇區(qū)分率為169，medium01/2〕700800或兩者皆選，每個通道的激光強度可分別在“Intensity”欄調整色矩形框，使其將膜的區(qū)域完全掩蓋〔留意：膜或膠一般均放置在掃描平面的左下方?？凵吓撋w開頭掃描和靈敏度，調整好后點擊“OK”按鈕確認NameOriginalAnalysis，點擊“OK”將未做更改的原始圖片保存如何中止掃描要提前中止掃描過程，可以點擊掃描掌握窗口中的“Stop”按鈕或者連續(xù)按兩次掃描儀面板上的“Stop”鍵，此時掃描圖像文件會被關閉并被保存下來，假設八.常見問題處理問題：高背景，但是是均勻分布的可能緣由封閉液中有Tween-20封閉液中有BSA沒有使用最正確的封閉試劑硝酸纖維素膜上的背景PVDF抗體濃度太高洗膜不徹底反響使用的抗體量不適宜膜的污染問題：背景上有不均勻的斑點分布可能緣由封閉液中同時處理了多張膜PonceauS膜沒有始終保持潮濕，局部被吹干使用的鑷子和容器被污染

建議在封閉完成前不要讓膜接觸到Tween-20永久不要將BSABSA不行逆的高背景對不同的封閉液進展比較找到最適合自己體系的封閉液；另外可以延長封閉時間在稀釋的抗體中參加 Tween-20從而降低背景。Tween-20的濃度需要依據(jù)所用的一抗進展優(yōu)化一般為0.05-1%削減或者除去稀釋抗體中的Tween-2牛奶作為封閉液的時候優(yōu)化一抗和二抗的稀釋倍數(shù)增加洗膜次數(shù)和洗膜液的量0.1%Tween-20,必要時可提高Tween-20，過量的Tween-20(0.5-1%)可能會使信號減弱。OdysseyIgG,IgG增加抗體的量，使膜完全浸沒其中。建議量能夠使全部的膜都能接觸到溶液同時移動自如。PonceauSPonceauS使膜的背景增高這一點格外重要。假設使用PVDF100%甲醇浸濕。。臟的鑷子會將染料帶到膜上，無法洗脫。孵育時使用干凈的鑷子和容器問題：信號微弱或者沒有信號可能緣由蛋白沒有成功從膠中轉移出來檢測過程中蛋白從膜上喪失使用的抗原量缺乏使用了錯誤的封閉液轉移過程中蛋白沒有保存在膜上

建議正確Odysseymarker對膠進展染色以確定沒有蛋白留在膠中過長的封閉時間或者抗體稀釋液中高濃度的Tween-20〔0.5-1%〕會導致膜上抗原局部喪失抗原。Odyssey液。使蛋白結合得更為結實。膜時的“三明治”中間是否有氣泡。〔不同的抗原同膜結合的力量不同〕在轉移液中添加20%的甲醇會有助于抗原同膜的結合〔成阻礙〕轉移液中的SDS備是那些低分子量的蛋白SS注使用的抗體量缺乏膜的類型不適宜

0.5SDS提高轉移效率。或者縮短轉移時間。適合的濃度。延長一抗得孵育時間〔室溫下4-8小時或者4℃過夜。增加二抗的量，優(yōu)化出最適合的濃度。由于放置時間過長或者保存不當抗體失去作用；用dotblotPVDF膜靈敏度更高。問題：消滅非特異性或者非預期的條帶可能緣由抗體