核酸提取送檢樣品要求課件

核酸提取

送檢樣本的要求核酸提取

送檢樣本的要求1一、樣本要求-送檢樣本類型1樣本類型穿刺的新鮮組織蠟塊高鹽浸泡的組織甲醛浸泡或固定的組織外周血（有核細胞）胸腹水骨髓穿刺血漿實體瘤血液病ctDNA循環(huán)腫瘤DNADNACTC循環(huán)腫瘤細胞融合基因&VEGFR2RNA除了檢測VEGFR2表達、融合基因EML4-ALK和ROS1可以送外周血和血漿之外，檢測其它RNA不建議送外周血及血漿（血液中RNA含量少濃度低，檢測出的結(jié)果不可靠）。一、樣本要求-送檢樣本類型1樣本類型穿刺的新鮮組織蠟塊高鹽浸2送檢樣本優(yōu)先級別：現(xiàn)有技術(shù)流程下1）、首選病理組織和穿刺組織（適合所有生物標志物biomarker）2）、其次為胸腹水（鑒定含腫瘤細胞后檢測為宜，不能檢測MSI）3）、最差用外周血（有核細胞能檢測SNP；血漿/血清能檢測ctDNA、融合基因、VEGFR2mRNA）外周血送檢樣本1）、抽提有核細胞→檢測SNP；2）、抽提血漿→檢測突變類（檢測ctDNA、融合基因、VEGFR2mRNA）

一、樣本要求-送檢樣本類型2送檢樣本優(yōu)先級別：現(xiàn)有技術(shù)流程下一、樣本要求-送檢樣本類型23二、樣本要求-送檢樣本量樣本類型穿刺的新鮮組織蠟塊高鹽浸泡的組織甲醛浸泡或固定的組織外周血（有核細胞）胸腹水骨髓穿刺血漿（分離好的）切片樣本量2～4根穿刺3um×20片黃豆大小黃豆大小5ml（EDTA抗凝管-紫色）100ml以上2～4根穿刺600ul1×1cm×10片抽提用量DNA1～2根穿刺10片芝麻大小芝麻大小5ml（EDTA抗凝管-紫色）6ml1～2根穿刺300ul3～5片抽提用量RNA1～2根穿刺10片芝麻大小芝麻大小5ml（EDTA抗凝管-紫色）6ml1～2根穿刺300ul3～5片二、樣本要求-送檢樣本量樣本類型穿刺的新鮮組織蠟塊高鹽浸泡的4三、樣本要求-保存方法新鮮組織（包括手術(shù)和活檢組織）價值：腫瘤新鮮冷凍材料可提取出最高品質(zhì)的DNA、RNA。在手術(shù)現(xiàn)場取樣的情況也比較多，但需要在顯微鏡下確認腫瘤細胞含量。周圍炎癥嚴重的腫瘤、黏液產(chǎn)生過高的腫瘤、病變中心廣泛纖維化的腫瘤細胞不能采集，以免產(chǎn)生假陰性結(jié)果。鑒定：切割后取其中一半，并利用另一半切面制作組織標本，然后在顯微鏡下確認腫瘤細胞含量。保存：理想的保存方法是迅速置于液氮中，然后保存于液氮罐或-80℃冰箱，這一過程應(yīng)在手術(shù)樣本離體后30分鐘內(nèi)完成?；蛘弑４嬖诮M織保存液中；也可保存在核酸提取液中。三、樣本要求-保存方法新鮮組織（包括手術(shù)和活檢組織）5三、樣本要求-保存方法石蠟包埋組織（formalin-fixedparaffin-embedded，F(xiàn)FPE）10%中性福爾馬林固定手術(shù)切除樣本，按病理學(xué)操作規(guī)范進行取材。DNA容易受固定的影響，長時間（1周以上）浸泡在福爾馬林中的樣本的DNA會被片段化，不能檢出突變。活檢材料的固定時間一般是24小時，對于穿刺等活檢樣本，固定時間控制在6~24小時為佳。價值：石蠟包埋組織易長期保存。鑒定：制作石蠟切片后，切取5片連續(xù)切片，其中1片進行HE染色，確認腫瘤細胞的含量。在高靈敏度檢測方法中，可考慮使用活檢標本。保存：15攝氏度~28攝氏度。三、樣本要求-保存方法石蠟包埋組織（formalin-fix6三、樣本要求-保存方法胸腹水等細胞學(xué)樣本用胸腹水中的腫瘤細胞用于基因檢測時，必須確認腫瘤細胞，穿刺獲得胸腹水樣本提交給細胞病理檢查之后，剩余液體冷藏/冷凍保存，由于細胞學(xué)樣本的腫瘤細胞含量較低，因此必須使用高靈敏度檢測方法。價值：取樣方便。鑒定：制作石蠟切片后，切取5片連續(xù)切片，其中1片進行HE染色，確認腫瘤細胞的含量。保存：離心收集后冷凍保存；也可在含有細胞成分的離心沉淀中加入含有蛋白質(zhì)變性劑的緩沖液（AL緩沖液，Qiagen公司）等室溫保存。三、樣本要求-保存方法胸腹水等細胞學(xué)樣本7三、樣本要求-保存方法外周血樣本價值：取樣方便。用途：ctDNA、CTC檢測保存：取樣時應(yīng)使用一次性密閉EDTA抗凝真空采血管，采集6~10ml全血，冷藏運輸，6小時內(nèi)分離血漿，提取游離DNA，保存到-80℃冰箱中，并避免反復(fù)凍融。如外周血需長時間運輸，建議用商品化的游離DNA樣本保存管，在常溫條件下，cfDNA在全血中可穩(wěn)定保存7天。血清或血漿離心收集后冷凍保存；有核細胞檢測CTC的冷藏保存，檢測SNP的冷凍保存。三、樣本要求-保存方法外周血樣本8名詞解釋實體瘤即有形瘤，可通過臨床檢查如x線攝片、CT掃描，B超、或觸診捫及到的有形腫塊稱實體瘤。非實體瘤即X線、CT掃描、B超及觸診無法看到或捫及到（摸到、按到）的腫瘤，如血液病中的白血病就屬于非實體瘤。血液病是原發(fā)于造血系統(tǒng)的疾病，或影響造血系統(tǒng)伴發(fā)血液異常改變，以貧血、出血、發(fā)熱為特征的疾病。造血系統(tǒng)包括血液、骨髓單核一巨噬細胞系統(tǒng)和淋巴組織，凡涉及造血系統(tǒng)病理、生理，并以其為主要表現(xiàn)的疾病，都屬于血液病范疇。名詞解釋實體瘤即有形瘤，可通過臨床檢查如x線攝片、CT掃描，9名詞解釋循環(huán)游離DNA(circulatingfreeDNA，cfDNA)是存在于血漿中的游離DNA，它們有的來自于正常細胞，有的來自于異常細胞（如腫瘤細胞），腫瘤來源的DNA占血漿游離DNA的比例在不同腫瘤及病例中相差懸殊（0.01~93%），從而限制了外周血在腫瘤分子檢測時的應(yīng)用。目前已有多篇文獻證實可利用從血漿游離DNA檢出突變，但需要使用ARMS法等靈敏度非常高的檢測方法。名詞解釋循環(huán)游離DNA(circulatingfreeD10名詞解釋循環(huán)腫瘤細胞（circulatingtumorcell，CTC），是存在于外周血中的各類腫瘤細胞的統(tǒng)稱。循環(huán)腫瘤DNA（circulatingtumorDNA,ctDNA），是指腫瘤細胞體細胞DNA經(jīng)脫落或者當細胞凋亡后釋放進入循環(huán)系統(tǒng)的DNA片段，是一種特征性的腫瘤生物標記，通過ctDNA檢測，能夠檢出血液中的腫瘤蹤跡。ctDNA檢測很少