一種結(jié)直腸癌基因檢測試劑盒的制作方法

一種結(jié)直腸癌基因檢測試劑盒的制作方法背景介紹結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤，早期發(fā)現(xiàn)、早期治療對于患者的生存期和生活質(zhì)量具有重要意義?；驒z測對于早期發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌有著重要作用，因此結(jié)直腸癌基因檢測已經(jīng)成為目前結(jié)直腸癌篩查的重要手段之一。因此，一種可操作、可靠、具有可擴(kuò)展性的基因檢測試劑盒備受關(guān)注。試劑盒制備方法結(jié)直腸癌基因檢測試劑盒的制備主要是從樣品的處理、DNA提取、引物的設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增、檢測等多個(gè)環(huán)節(jié)來完成的。樣品處理樣品類型主要包括組織、血液、尿液等，其中組織是常見且較為常用的樣品類型。樣品的處理是基因檢測中至關(guān)重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，而組織樣品的處理主要包括以下幾個(gè)步驟：樣品預(yù)處理a.提前將樣品加入RNAlater穩(wěn)定液中，RNAlater穩(wěn)定液能夠防止RNA和DNA降解，從而維持樣品的完整性；b.放置在4°C的冰箱中保存。樣品研磨a.從RNAlater穩(wěn)定液中將樣品取出，去除過多的RNAlater穩(wěn)定液；b.將樣品切成小塊；c.使用組織研磨器（或者手持組織研磨器），將樣品均勻地研磨成細(xì)胞狀態(tài)；d.使用DNA純化試劑盒提取DNA。DNA提取a.使用DNA純化試劑盒提取DNA；b.使用Nuclease-freeWater溶解DNA，濃度為50ng/μL，儲(chǔ)存在-20°C的冰箱中。引物的設(shè)計(jì)在設(shè)計(jì)基因檢驗(yàn)試劑盒的引物時(shí)，需要考慮以下幾個(gè)方面：引物激發(fā)溫度：探針和引物的激發(fā)溫度要適合目標(biāo)DNA的共同不變的可區(qū)域。引物長度：引物不應(yīng)過短或過長，否則容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。高特異性：保證引物的特異性，降低假陽性、假陰性的概率。降低突變率：選擇引物時(shí)要減少基因多態(tài)性對引物的影響，減少假陰性或假陽性的概率。PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增是基因檢測中極其重要的步驟，是將DNA放大到足夠多的數(shù)量以供檢測，PCR擴(kuò)增主要包括以下幾個(gè)方面：加入PCR體系，根據(jù)供應(yīng)商說明添加引物、酶等物質(zhì)。使用制備出的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。分別采用Real-timePCR或常規(guī)PCR方法進(jìn)行檢測。結(jié)果檢測結(jié)果檢測的主要任務(wù)是檢測PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物是否符合目標(biāo)基因位點(diǎn)。檢驗(yàn)方法有很多種，但公認(rèn)的常用方法是多重?zé)晒舛縋CR檢測法，包括TaqMan探針和SYBRGreen探針（SYBRGreen探針的背景較高，檢測到的結(jié)果需要再次驗(yàn)證）。優(yōu)點(diǎn)結(jié)直腸癌基因檢測試劑盒的制作方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：操作簡便：制備過程操作簡便，不需要復(fù)雜的技術(shù)，適合實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的技術(shù)工作人員進(jìn)行操作?？煽啃愿撸簻y試結(jié)果的準(zhǔn)確性及可靠性等要求比較高，所以試劑的特異性是制備中需要重點(diǎn)考慮的問題。本試劑盒研究重點(diǎn)針對目標(biāo)基因序列開發(fā)特異性高的PCR引物?？蓴U(kuò)展性好：本試劑盒試劑上下游引物設(shè)計(jì)合理、比較短，可以對病原體亞型進(jìn)行覆蓋，同時(shí)在PCR反應(yīng)體系中加入2個(gè)較小的DNA分子探針。因此是一種可擴(kuò)展的試劑盒，可應(yīng)用于結(jié)直腸癌基因檢測領(lǐng)域。結(jié)論目前，結(jié)直腸癌基因檢測已經(jīng)成為