不同松樹接種松材線蟲后no和核酸酶活性的變化

不同松樹接種松材線蟲后no和核酸酶活性的變化

松草病是松草病引起的一種綜合性疾病。這種疾病在中國許多省份都很流行，給森林和生態(tài)系統(tǒng)以及經(jīng)濟發(fā)展帶來了重大損失。由于松材線蟲的致病機制以及松樹的抗病機制尚未明確,這給松材線蟲病的防治帶來了困難。國內(nèi)外學(xué)者在松材線蟲病的致病機制、組織病理學(xué)和病理生理學(xué)等方面做了大量研究(劉軍民等,1995;金鋼,2007;厲艷,2008),很多研究表明松樹與松材線蟲互作早期某些次生代謝物質(zhì)的快速變化與松樹的抗病性有直接關(guān)系,有些可誘導(dǎo)松樹的防衛(wèi)反應(yīng)(Sugaetal.,1993),并與松材線蟲病的發(fā)展趨勢一致。近年來,大量研究表明一氧化氮(NO)是調(diào)控植物抗感病信號的重要信號分子(Gouveaetal.,1997)。許多報道證實NO可參與大豆(Glycinemax)-假單胞菌(Pseudomonassp.)、煙草-TMV和擬南芥(Arabidopsisthaliana)-丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)的抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Wendehenneetal.,2004)。此外,NO偶聯(lián)于cGMP,促進cADP核糖(cADP-ribose,cADPR)的合成,后者是有效的鈣離子激活劑,偶聯(lián)于胞內(nèi)鈣通道,激活第2信使鈣離子的釋放,誘導(dǎo)寄主細胞過敏性反應(yīng)(Clarketal.,2000)。NO還能和活性氧互作共同誘導(dǎo)細胞過敏性反應(yīng)和細胞膜質(zhì)過氧化(Durneretal.,1998),這些均是植物抗病反應(yīng)中的關(guān)鍵性生理生化過程。劉劼等(2008)研究認為超氧自由基可能在松樹與松材線蟲互作早期具有重要作用。同時,有關(guān)植物細胞程序性死亡(PCD)的研究發(fā)現(xiàn)植物PCD發(fā)生與多種核酸酶相關(guān)。一些研究結(jié)果表明核酸酶可能參與植物細胞的分化、過敏性反應(yīng)、脅迫反應(yīng)、抗逆反應(yīng)和葉片老化等過程,并在其中起著重要作用(Neilletal.,2003;Mittleretal.,1997)。但有關(guān)NO和核酸酶在松材線蟲病中的作用研究鮮見報道。前人研究表明不同松樹品種對松材線蟲的抗性與植物抗病反應(yīng)(細胞過敏性反應(yīng)和膜脂過氧化)有密切關(guān)系(陳玉惠等,2002)。大量研究表明:火炬松(Pinustaeda)對松材線蟲表現(xiàn)為高度抗病,馬尾松(P.massoniana)中度感病,黑松(P.thunbergii)高度感病(楊寶君等,1993)。不同抗性松樹與松材線蟲互作中NO和核酸酶的變化規(guī)律是否一致,其變化是否與松樹的抗性存在一定的相關(guān)性至今未見相關(guān)研究報道。本研究以火炬松、馬尾松和黑松為研究對象,比較不同抗性松樹接種松材線蟲后內(nèi)源NO和核酸酶變化的差異,以期弄清NO和核酸酶在該互作體系中的功能作用,為闡明松材線蟲病的致病機制和松樹的抗病機制提供一定的參考依據(jù)。1材料和方法1.1接種苗的制備松材線蟲17#蟲株采自江蘇連云港黑松。采用貝爾曼漏斗法分離純培養(yǎng)保存的松材線蟲,將獲得的線蟲用0.1%硫酸鏈霉素表面消毒5min,再用無菌水洗滌3次后,移置長滿灰葡萄孢(Botrytiscinerea)的PDA平板上。25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天,用于接種試驗。供試松苗為3年生、生長較一致、健康的馬尾松、黑松和火炬松盆栽苗(采自安徽),平均苗高和地徑分別約為30cm和2cm。采用人工皮接法(方中達,1998)接蟲,接種點為苗高20cm處松莖。供試松材線蟲接種量均為每毫升6000條,接種后棉球保濕12h,然后置于30℃、16h·d1.2黑松no含量檢測各處理松苗于接種后4,12,24,48,72,96和120h分別取各處理松苗接種部位以上1cm處針葉,剪碎、混勻后各稱取1.2g。用液氮研磨,然后加入8.4mL預(yù)冷的磷酸緩沖液(PBS)(pH7.4,10mmol·LNO檢測采用硝酸還原酶法,采用購自南京建成生物工程研究所(批號20090627及20090704)一氧化氮檢測(硝酸還原酶法)試劑盒對黑松體內(nèi)的NO含量進行檢測。NO測定按試劑盒說明書操作。1.3研磨法制備核酸酶活性分別取各處理松苗接種部位以上1cm處針葉1g放入先用液氮冷卻好的干凈研缽里研磨,然后加入2.5mL冷卻的50mmol·L核酸酶活性測定參照Wood等(1998)方法。單鏈DNA由小牛胸腺DNA水溶液(1mg·mL1.4數(shù)據(jù)處理和分析將所獲得的各數(shù)據(jù)采用SPSS13.0在顯著水平P=0.05下進行統(tǒng)計學(xué)分析。2結(jié)果與分析2.13種松樹與松材線蟲互作中no含量的變化經(jīng)測定,3種松樹健康狀態(tài)下(CK2)針葉內(nèi)NO平均含量為:火炬松2130.30μmol·g3種松樹在割傷只接無菌水(CK1)的處理中,火炬松和馬尾松針葉內(nèi)NO含量在4h時較其健康狀態(tài)值都有所升高,火炬松升高幅度比馬尾松大,而黑松基本與其健康狀態(tài)值持平;在24h時,3種松樹CK1的NO含量迅速下降,都低于其健康狀態(tài);48h時黑松和馬尾松CK1處理的與其健康狀態(tài)基本持平,而火炬松CK1處理的NO含量較其健康狀態(tài)有所升高;72～120h時黑松和馬尾松的CK1處理有所升高(高于其健康狀態(tài)),但變化幅度較小,而火炬松CK1處理的有所下降,低于其健康狀態(tài)(圖1a)。3種松樹感染松材線蟲后4～24h,黑松針葉內(nèi)NO含量先升后降,火炬松和馬尾松的一直處于下降趨勢;在12h時3種松樹體內(nèi)的NO含量為黑松>馬尾松>火炬松且差異較明顯,并在24h達到顯著差異。與其割傷僅接無菌水的處理(CK1)相比,黑松和和馬尾松針葉內(nèi)NO含量都明顯高于其CK1,而火炬松低于其CK1。48h時,3種松樹針葉體內(nèi)NO含量都開始升高,黑松較其CK1升高67%,馬尾松較其CK1升高16%,火炬松較其CK1升高9%;此時3種松樹體內(nèi)的NO含量差異顯著,為黑松>馬尾松>火炬松,但這種差異在48h后不明顯?？梢娝蓸涫芮趾蟮?～48h階段可能是松材線蟲病發(fā)生發(fā)展的一個關(guān)鍵時期。48h后,3種松樹針葉內(nèi)NO含量繼續(xù)升高且明顯高于其CK1,其中火炬松在72h達到其峰值(高于其CK1約66.4%);黑松和馬尾松在96h達到峰值(分別高于其CK1約17%和39.1%),較火炬松晚24h(圖1b,c)。由此可見,在接種后期(72～120h)火炬松NO峰值比黑松和馬尾松出現(xiàn)早,且3種松樹較其CK1升高幅度為火炬松>馬尾松>黑松。這說明在接種后期松樹針葉內(nèi)NO峰值出現(xiàn)的先后及較割傷只接無菌水處理上升幅度的大小與松樹的抗性存在正相關(guān)。2.2種松樹與火炬松單鏈核酸酶活性的比較黑松、馬尾松和火炬松在健康狀態(tài)下針葉內(nèi)單鏈核酸酶的平均活性無顯著性差異(圖2a)。割傷處理(CK1)后3種松樹針葉內(nèi)的單鏈核酸酶變化在4～12h存在差異:4h時單鏈核酸酶活性火炬松>馬尾松>黑松;12h時火炬松的單鏈核酸酶活性下降,而黑松和馬尾松的處理則有所升高,基本處于同一水平,并高于火炬松;在12h后3種松樹割傷處理的單鏈核酸酶活性無顯著差異,但24h后火炬松一直稍高于馬尾松和黑松(圖2a)。這說明火炬松對傷口的反應(yīng)比馬尾松和黑松更敏感。3種松樹接種松材線蟲后,4h時針葉內(nèi)單鏈核酸酶活性大小依次為:火炬松、馬尾松、黑松,與其各自割傷處理(CK1)相比,黑松升高50%,馬尾松升高15%,火炬松升高13%。12～48h,火炬松針葉內(nèi)單鏈核酸酶活性的上升幅度比黑松和馬尾松的都高,48h時3種松樹體內(nèi)單鏈核酸酶的活性大小依次為:火炬松、馬尾松、黑松;48～72h,黑松的單鏈核酸酶活性迅速升高并達到峰值(較僅割傷處理的高205%),而馬尾松和火炬松的呈下降趨勢。120h時,火炬松和馬尾松針葉內(nèi)的單鏈核酸酶迅速升高,而黑松則迅速下降(見圖2b,c)。由此表明,3種松樹接種松材線蟲后,其針葉內(nèi)單鏈核酸酶的變化與松樹的抗病性存在一定的相關(guān)性,尤其在24h時表現(xiàn)最為明顯。2.3種松樹與松材線蟲互作中雙鏈核酸酶的變化黑松、馬尾松和火炬松健康狀態(tài)下針葉內(nèi)雙鏈核酸酶活性變化幅度較小,其平均值無顯著性差異(圖3a)。3種松樹割傷只接無菌水的處理雙鏈核酸酶活性在12h后都有所升高;至24h為黑松>火炬松>馬尾松,隨后黑松迅速下降,火炬松則有所升高;48h時為火炬松>馬尾松>黑松;48h后3者無顯著差異(圖3a)。3種松樹感染松材線蟲后,其針葉內(nèi)雙鏈核酸酶活性變化趨勢存在明顯差異。4h時,針葉內(nèi)雙鏈核酸酶的活性大小依次為:馬尾松、黑松、火炬松,較其割傷處理(CK1)升高幅度大小亦為馬尾松>黑松>火炬松。接種4h后,3種松樹針葉內(nèi)雙鏈核酸活性迅速上升,其上升趨勢火炬松>馬尾松>黑松,接種12h時火炬松針葉內(nèi)雙鏈核酸活性接近黑松;這說明接種松材線蟲后4～12h,火炬松體內(nèi)雙鏈核酸酶活性上升速度比黑松快。接種24h后,火炬松針葉內(nèi)雙鏈核酸酶的變化幅度平緩,黑松和馬尾松則迅速升高,48h時活性大小依次為:馬尾松、黑松、火炬松,此時黑松較其CK1升高幅度接近馬尾松,且明顯高于火炬松。接種48h后,火炬松體內(nèi)雙鏈核酸酶活性迅速上升,黑松變化平緩,馬尾松則迅速下降,在72h時馬尾松體內(nèi)雙鏈核酸酶活性基本與黑松持平,且均高于火炬松,此時3種松樹較割傷升高的幅度無顯著差異。接種后96～120h,火炬松和馬尾松針葉內(nèi)雙鏈核酸酶的活性迅速升高,而黑松則迅速下降(圖3b,c)。3接種松材線蟲后與松樹生長的關(guān)系NO在植物中具有廣泛的調(diào)節(jié)功能,特別是在植物-病原菌互作過程引發(fā)的與抗病相關(guān)的細胞死亡和基因表達中起關(guān)鍵作用。NO對植物體的作用具有雙重性:一方面,可通過與有效分子反應(yīng)而直接起作用或通過改變細胞氧化還原電位差而間接起作用,參與植物的生長發(fā)育和對環(huán)境適應(yīng)的信號傳導(dǎo)過程,是信號網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的關(guān)鍵物質(zhì)(王淼等,2005)。一方面,高濃度NO與O在3種松樹與松材線蟲互作過程中,其體內(nèi)NO含量在12h時黑松>馬尾松>火炬松,且在24～48h時達到顯著差異。此時松樹體內(nèi)松材線蟲的數(shù)量多少依次為:黑松、馬尾松、火炬松(何龍喜,2010)。吳小芹等(2008)研究發(fā)現(xiàn)普通黑松在接種松材線蟲4h后其皮層就發(fā)現(xiàn)大量線蟲,而在抗性黑松的皮層則很少線蟲。有研究表明適量的NO可以抑制過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)的活性,從而抑制膜脂的過氧化;而高濃度的NO可與O大量研究表明松樹割傷后泌脂速度大小依次為火炬松、馬尾松、黑松(束慶龍等,2006)。在本研究割傷只接無菌水的處理中,火炬松和馬尾松針葉內(nèi)NO在4h時較其健康狀態(tài)的含量均有所升高,且火炬松升高幅度比馬尾松大,而黑松基本與其健康狀態(tài)值持平?？梢娍剐詮姷乃蓸鋵Ω顐姆磻?yīng)更敏感,NO含量在割傷早期的迅速升高可能與其誘導(dǎo)早期的防御反應(yīng)有關(guān)。這似乎可推測,在自然界中火炬松在天牛取食制造傷口時,可能由于其松脂分泌迅速,使得天牛體上攜帶的松材線蟲不易進入松樹體內(nèi),而黑松和馬尾松則可能由于未能迅速分泌大量的松脂而易受到松材線蟲的侵害。近年研究發(fā)現(xiàn):核酸酶在植物細胞分化,寄主對病原菌的過敏性反應(yīng),寄主對環(huán)境脅迫的反應(yīng)和葉片衰老等中具有重要的作用。在煙草過敏性反應(yīng)中,核酸酶NUCⅠ、核酸酶Ⅱ和核酸酶Ⅲ被誘導(dǎo),并且與煙草細胞死亡同步(Ryersonetal.,1996)。Wood等(1998)在大麥(Hordeumulgare)葉片衰老的研究中發(fā)現(xiàn)黑夜能誘導(dǎo)核酸酶活性升高,并導(dǎo)致葉片衰老,并指出不同的植物可能存在對核酸酶不同的調(diào)控機制。本研究表明黑松、馬尾松和火炬松接種松材線蟲后,其針葉內(nèi)單鏈核酸酶活性在4～48h時為火炬松>馬尾松>黑松,而雙鏈核酸酶的活性在4～96h火炬松卻一直低于馬尾松和黑松,這表明不同松樹體內(nèi)