土壤中產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌淀粉酶活力測(cè)定

土壤中產(chǎn)淀粉酶芽抱桿菌淀粉酶活力測(cè)定

(3,5-二硝酸水楊酸顯色法)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簻y(cè)定土壤中產(chǎn)淀粉酶芽抱桿菌的淀粉酶活性實(shí)驗(yàn)原理：酶活性的測(cè)定是通過(guò)測(cè)定一定量的酶在一定時(shí)間內(nèi)催化得到的麥芽糖的量來(lái)實(shí)現(xiàn)的，淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖，可用3,5-二硝基水楊酸試劑測(cè)定，由于麥芽糖能將后者還原生成硝基氨基水楊酸的顯色基團(tuán)，將其顏色的深淺與糖的含量成正比，故可求出麥芽糖的含量。常用單位時(shí)間內(nèi)生成麥芽糖的毫克數(shù)表示淀粉酶活性的大小。然后利用同樣的原理測(cè)得兩種淀粉酶的總活性。實(shí)驗(yàn)器材及試劑：高速離心機(jī)、分光光度計(jì)(1)粗酶液制備：以一環(huán)菌種接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)，160rpm/min，37°C，48h。4000rpm/min李鑫20min，收集上清液即為待測(cè)粗酶液；⑵1mg/ml標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖的制備：準(zhǔn)確稱(chēng)量100mg麥芽糖，用蒸餾水準(zhǔn)確定容到100ml；3,5-二硝基水楊酸試劑的制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取3,5-二硝基水楊酸1g，溶于20mL2mol/LNaOH溶液中，加入50mL蒸餾水，再加入30g酒石酸鉀鈉，待溶解后，用蒸餾水定容到100mL，蓋緊瓶塞，備用；0.1mlo/LpH5.6的檸檬酸緩沖液的制備準(zhǔn)確稱(chēng)取4.62g檸檬酸和17.05g檸檬酸鈉，用蒸餾水定容到800mL；1%淀粉溶液的制備準(zhǔn)確稱(chēng)取1g淀粉于100mL0.1mol/LpH5.6的檸檬酸鹽緩沖液中；標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

表3標(biāo)準(zhǔn)曲線制作表1234567麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液00.20.611.41.82（mL）蒸餾水（mL）21.81.410.60.20麥芽糖含量/mg00.20.611.41.823,5-二硝基水楊1.51.51.51.51.51.51.5酸（ml）標(biāo)準(zhǔn)樣液配置按上表配制完成，搖勻，置沸水浴中煮沸10min。取出后流水冷卻，加蒸餾水定容至20mL。以一號(hào)試管作為空白對(duì)照，520nm比色測(cè)定吸光度。以麥芽糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（7）測(cè)定取10mL具塞可第十關(guān)，預(yù)先潔凈滅菌干燥、編號(hào)。按下表配制溶液，定容后搖勻，用分光光度計(jì)測(cè)定在520nm下的OD值。表4淀粉酶活側(cè)定表空白對(duì)照1號(hào)菌①1號(hào)菌②4號(hào)菌①4號(hào)菌②粗酶液（mL）11111濃HCl（mL）10000預(yù)溫：40°C水浴10min1%淀粉溶液11111（mL）精確保溫：40C水浴5min濃HCl（mL）011113，5-二硝基水22222楊酸（mL）沸水浴10min⑻計(jì)算根據(jù)測(cè)到的OD值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線中找到相應(yīng)的麥芽糖量，并在上述條件下以單位體積樣品在30min釋放1mg麥芽糖所需的酶量為一個(gè)麥芽糖單位（MM）酶活力，按下式計(jì)算出淀粉酶的活力。淀粉酶活力=麥芽糖釋放量（mg）*6*稀釋倍數(shù)（9）實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線淀粉酶活力