枯草芽孢桿菌y13uv在油茶體內的定殖動態(tài)

枯草芽孢桿菌y13uv在油茶體內的定殖動態(tài)

在油茶生產(chǎn)中，油茶糖蜜是最重要的疾病，通常發(fā)生在不同的主要生產(chǎn)區(qū)，導致嚴重的落葉、果實和落葉林，以及產(chǎn)量降低（楊華等，2015）。目前,防治油茶炭疽病主要是采取化學防治和生物防治手段(陳彧等,2010)。但大量使用化學農藥容易導致植物病原菌產(chǎn)生抗藥性,造成環(huán)境污染,引起人畜中毒等問題(周國英等,2007)。國內外已有不少關于生物防治植物病害的報道。周建宏等(2011)通過對40多種植物進行篩選,利用篩選出來的丁香(Syringaoblata)和黃苓(Scutellariabaicalensis)研制出了防治油茶炭疽病的純植物源農藥。宋光桃(2009)從油茶林土壤中分離出了對油茶炭疽病具有拮抗作用的放線菌CF17。美國Agraquest公司(2001)將枯草芽孢桿菌QST713制成生物殺菌劑,具有廣譜性。利用能夠在寄主植物體內定殖的內生拮抗菌對病害進行防治具有獨特的優(yōu)勢(楊光道等,2009),實際應用中拮抗作用強并不一定是最好的生防因子,生防菌能否在植株體內定殖才是取得防效的關鍵。研究內生細菌定殖的常用方法有同位素示蹤法(葛銀林等,1995)、免疫學方法(劉云霞等,1996)、抗生素標記法(吳藹民等,2001)、熒光標記法(殷幼平等,2010)。熒光標記中的綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)熒光性能穩(wěn)定、無需外源反應底物、對宿主細胞無毒害作用、檢測方便,成為研究微生物與宿主或環(huán)境互作的重要工具(王卿等,2015)。劉郵洲等(2014)發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白基因標記的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)在番茄(Lycopersiconesculentun)根際土壤中有一定的定殖能力,接種30天后仍可檢測到標記菌株。杜芳等(2015)研究了枯草芽孢桿菌Y10在白菜(Brassicarapa)根、莖及葉部組織的定殖情況,結果表明枯草芽孢桿菌在白菜體內有良好的定殖能力,且這種特性可能與其防治根腫病有關。Yang等(2013)將攜帶質粒gfpmut3a基因的穿梭載體pGFP4412導入生防枯草芽孢桿菌中,通過浸種、蘸根以及灌根接種研究其在黃瓜(Cucummissativus)根表的定殖,發(fā)現(xiàn)在根基部和中部都有標記菌株聚集而形成膜狀結構,在根的分叉和根冠處可觀察到大量標記菌株。關于綠色熒光蛋白標記枯草芽孢桿菌在油茶體內定殖的研究,國內目前未見相關報道。1材料和方法1.1供試油茶苗及試劑供試質粒和內切酶:pHT315-GFP,高效表達綠色熒光蛋白基因的大腸桿菌(Escherichiacoli)一蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)穿梭載體,HindⅢ和XbaⅠ內切酶均由本實驗室保存。供試油茶苗:湘林210品種,2年生健康盆栽苗,購于湖南省林業(yè)種苗中心;長勢、苗高、大小一致。1.2gfp標記細菌y13參考陳燕紅等(2014)的方法,本實驗室自行構建標記菌株。1.2.1熒光顯微鏡檢測挑取少許綠色熒光蛋白標記菌株菌體涂布固定,蓋上蓋玻片,在熒光顯微鏡下檢測(激發(fā)光波長480nm,發(fā)射光波長520nm),觀察有無熒光產(chǎn)生。1.2.2gfp標記植物生長動力學1.2.3gfp標記菌株培養(yǎng)采用平板對峙法:取炭疽病菌菌餅放在PDA平板中央,將GFP標記菌株接種至距離炭疽病菌1.5cm處,置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中。待朝向標記菌株方向的病原菌菌落不再生長時,采用十字交叉法測量菌落直徑,計算抑菌率。1.3gfp顯示了油茶體內菌株的定殖動態(tài)1.3.1單次接種和監(jiān)測hfp檢測菌株在油茶體內的固定繁殖動態(tài)采用噴葉法、灌根法和噴葉灌根結合法接種標記菌菌懸液,濃度為3.2×101.3.2用量特征單次接種7天后,進行第2次接種。采用的接種方法、菌液濃度及用量與1.3.1相同。分別于接種后1,3,5,10,15,20,30天對油茶根、莖、葉進行取樣回收,每處理隨機抽取3株,每份組織樣品0.5g,直至回收不到標記菌株。1.3.3熒光顯微鏡觀察分別稱取油茶苗根、莖、葉組織各0.5g,經(jīng)表面消毒后研磨成勻漿,分別取0.1mL各梯度稀釋液涂布LB氯霉素抗性平板,28℃培養(yǎng)2~3天,在熒光顯微鏡下觀察熒光菌落數(shù)。用接種環(huán)挑取單菌落到10mlLB液體培養(yǎng)基中,37℃、180r·min1.4數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)均為平均數(shù)±標準誤差,采用Excel2007和SPSS19.0軟件處理,顯著性水平采用Duncan’s新復極差法分析。2結果與分析2.1綠色熒光蛋白標記阿波羅y132.1.1綠色熒光蛋白標記y13綠色熒光蛋白標記菌株構建好之后,挑取標記菌株于載玻片上涂布并固定,在熒光顯微鏡下檢測到菌株發(fā)熒光(圖1),并將綠色熒光蛋白標記菌株記為Y132.1.2綠色熒光蛋白標記y132.1.3綠色熒光蛋白標記y13從表1可知:標記菌株Y132.2y13植物標記2.2.1識別標記植物的回收和鑒定從LB平板上挑取的Y132.2.2接種方式對y13的影響如表2所示:灌根處理當天,油茶苗根部能夠檢測到Y13噴葉處理后,根、葉片、莖下部位的Y13噴葉灌根結合處理后,接種后1天根部定殖數(shù)量為2.00×10綜合來看,3種接種方式下Y132.2.3重復播種監(jiān)測y131)灌根接種標記菌株Y132)噴葉接種標記菌株Y133)噴葉灌根接種標記菌株Y133種方式的定殖量采用噴葉法、灌根法、噴葉灌根結合法3種接種方法接種,均能使標記菌株侵入油茶根莖葉內,并在油茶植株體內繁殖和傳導。單次接種時,3種接種方式下標記菌株的定殖時間短,不同接種方式的定殖量存在差異。重復接種使標記菌株在油茶體內的定殖時間長達30天,噴葉灌根結合處理30天后,根部定殖量為5.3×10王瑞芹(2014)用抗利福平標記Y13菌株,雖然抗利福平標記的菌株與綠色熒光蛋白標記的菌株在油茶體內定殖沒有顯著性差異,但抗性菌株接種到植物后,部分菌株會因為在植物體內沒有了選擇壓力而在增殖過程中丟失了抗利福平的能力(范曉靜,2007),再者植物內生菌有些也可能對利福平具有抗藥性,從而造成分離到的細菌數(shù)量不準確,綠色熒光蛋白基因標記就減小了分離菌量與實際定殖菌量的差異。4增加了葉內定殖的菌株在葉內的定殖枯草芽孢桿菌Y13供試菌株:枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Y13挑取GFP標記菌單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中,30℃、200r·min從圖2可以看出,綠色熒光蛋白標記菌株Y13研究中發(fā)現(xiàn),單次接種時Y13噴葉灌根結合處理30天后,葉片中的定殖數(shù)量比根部多,相比噴葉灌根單獨處理的效果好。出現(xiàn)這一結果,筆者分析其原因可能是綜合處理增強了菌株在葉內的定殖效果。葉內的標記菌株包括從根部進入并傳遞到葉片的標記菌株和直接從葉片侵入的標記菌株,更多的標記菌株