浙科版一輪公開課復(fù)習(xí)動(dòng)物的克隆公開課一等獎(jiǎng)?wù)n件省賽課獲獎(jiǎng)?wù)n件

動(dòng)物克隆第1頁動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)克隆培養(yǎng)法單克隆抗體細(xì)胞核移植動(dòng)物克隆常用技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞融合動(dòng)物克隆技術(shù)基礎(chǔ)是動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)細(xì)胞工程主要伎倆是細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞融合第2頁資料：培養(yǎng)細(xì)胞生存環(huán)境

1.無菌、無毒環(huán)境：添加一定量抗生素，定期更換培養(yǎng)液2.合適溫度和PH：35-37℃;PH:7.2-7.43.氣體環(huán)境（CO2培養(yǎng)箱）4.特殊培養(yǎng)液：主要有：葡萄糖、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素和動(dòng)物血清等調(diào)整PH，模擬人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞在體內(nèi)最適環(huán)境思考：較植物組培培養(yǎng)基有何獨(dú)特之處？1.液體培養(yǎng)基；2.葡萄糖.3、動(dòng)物血清含激素，確保細(xì)胞順利生長增殖第3頁細(xì)胞全能性細(xì)胞株、細(xì)胞系植物體培養(yǎng)成果取得細(xì)胞或細(xì)胞產(chǎn)物培育新植株等培養(yǎng)目葡萄糖、動(dòng)物血清蔗糖、植物激素培養(yǎng)基特有成份液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基性質(zhì)細(xì)胞增殖原理動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)比較項(xiàng)目植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)比較第4頁一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)首先，將動(dòng)物體內(nèi)一部分組織取出，通過機(jī)械消化或胰酶消化，使其分散成單個(gè)細(xì)胞；然后，在人工控制培養(yǎng)條件下，使這些細(xì)胞得以生存，并保持生長、分裂乃致接觸抑制和有規(guī)律衰老、死亡性能等生命活動(dòng)現(xiàn)象。注意：細(xì)胞之間在生命活動(dòng)中互相依存，因此也像體內(nèi)同樣展現(xiàn)一定組織特性。第5頁細(xì)胞貼壁細(xì)胞貼壁：細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，懸液中分散細(xì)胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細(xì)胞貼壁。要求：培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿內(nèi)表面光滑、無毒、易于貼附。在培養(yǎng)過程中，細(xì)胞會(huì)構(gòu)造和功能變化第6頁細(xì)胞在貼壁生長過程中,伴隨細(xì)胞分裂,數(shù)量不停增加,最后形成一種單層,此時(shí)細(xì)胞間互相接觸,細(xì)胞分裂和生長停頓。接觸抑制第7頁第8頁成纖維細(xì)胞型：第9頁思考幾個(gè)問題1、在大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)中都不直接使用人皮膚作為材料而是選用動(dòng)物胚胎或幼齡個(gè)體器官或組織,為何？2、為何培養(yǎng)前要將組織細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞？3、胰蛋白酶作用？胃蛋白酶能夠嗎？4、為何要分裝？5、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)能否像綠色植物組織培養(yǎng)那樣最后培養(yǎng)成新個(gè)體？培養(yǎng)細(xì)胞會(huì)因細(xì)胞密度過大和代謝消耗引發(fā)營養(yǎng)枯竭，不能正常生長。不能，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)只能使細(xì)胞數(shù)目增多，不能發(fā)育成新動(dòng)物個(gè)體由于這些組織或器官上細(xì)胞生命力旺盛，分裂能力強(qiáng)成塊組織不利培養(yǎng)，分散了做成細(xì)胞懸浮液利于培養(yǎng)第10頁有關(guān)概念原代培養(yǎng)：從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)細(xì)胞為原代細(xì)胞。一般是指從開始到傳至10代細(xì)胞培養(yǎng)傳代培養(yǎng)：將原代細(xì)胞提成若干份，接種到其他培養(yǎng)基中，使其繼續(xù)生長繁殖。傳代培養(yǎng)一般指10-50代細(xì)胞培養(yǎng)第11頁細(xì)胞原代培養(yǎng)

將動(dòng)物機(jī)體多種組織從機(jī)體中取出，經(jīng)多種酶（常用胰蛋白酶）或機(jī)械辦法處理，分散成單細(xì)胞，置合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。

第12頁胰酶消化法1、取材：用手術(shù)剪將組織剪成小塊（1mm2），再洗三次，轉(zhuǎn)移至小青霉素瓶中。4、視組織塊量加入胰酶液，37℃中消化20—40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次.5、加入2ml培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）,用吸管吹打，沖散細(xì)胞。6、靜置，使未分散組織塊下沉。7、吸取上層細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移到兩個(gè)培養(yǎng)皿中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)液，37℃下培養(yǎng)。第13頁（一）培養(yǎng)細(xì)胞生命期在培養(yǎng)中連續(xù)增殖和生長時(shí)間。

第14頁1．原代培養(yǎng)期：從體內(nèi)取出組織,接種培養(yǎng)到第一次傳代階段（初代培養(yǎng)）特點(diǎn)：細(xì)胞呈活躍移動(dòng)、可見細(xì)胞分裂、形態(tài)構(gòu)造和功能活動(dòng)上與體內(nèi)原組織相同性、多呈二倍體核型細(xì)胞群是異質(zhì)，細(xì)胞克隆形成率很低，即細(xì)胞獨(dú)立生存性差。第15頁2．傳代期：初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系。在全生命期中此期連續(xù)時(shí)間最長。在培養(yǎng)條件較好情況下，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞系。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右，細(xì)胞增殖逐漸遲緩，以至完全停頓，細(xì)胞進(jìn)入第三期。第16頁3．衰退期：此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，最后衰退凋亡。在細(xì)胞生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點(diǎn)，由于某種原因影響，細(xì)胞也許發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化標(biāo)志之一是細(xì)胞也許取得永生性或惡性。第17頁細(xì)胞永生性也稱不死性，即細(xì)胞獲持久性增殖能力，這樣細(xì)胞群體稱無限細(xì)胞系，也稱連續(xù)細(xì)胞系。無限細(xì)胞系形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細(xì)胞獲不死性后，核型大多變成異倍體。細(xì)胞轉(zhuǎn)化亦可用人工辦法誘發(fā)，轉(zhuǎn)化后細(xì)胞也也許具有惡性性質(zhì)。細(xì)胞永生性和惡性性非同一性狀。第18頁細(xì)胞懸液10代細(xì)胞50代細(xì)胞無限傳代原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)總結(jié)多呈二倍體核型細(xì)胞群是異質(zhì)傳代后稱做細(xì)胞系轉(zhuǎn)化細(xì)胞也許取得永生性或惡性—異體致瘤永生性也稱不死性，又稱無限細(xì)胞系，也稱連續(xù)細(xì)胞系，大多變成異倍體有限細(xì)胞系（二倍體）第19頁細(xì)胞系、細(xì)胞株細(xì)胞株：通過一定選擇或純化辦法，從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中取得具有特殊性質(zhì)細(xì)胞，稱為細(xì)胞株。特點(diǎn)：一般具有恒定染色體組型、同功酶類型、病毒敏感性和生化特性等。連續(xù)細(xì)胞株：能夠連續(xù)數(shù)次傳代有限細(xì)胞株：可傳代次數(shù)有限細(xì)胞系：異質(zhì)性細(xì)胞株：純系第20頁★如何取得純系細(xì)胞系？把一種細(xì)胞從群體中分離出來單獨(dú)培養(yǎng)（克隆培養(yǎng)法）第21頁二、克隆培養(yǎng)法1、克隆培養(yǎng)法概念：把一種細(xì)胞從群體中分離出來培養(yǎng)，使之繁殖成一種新細(xì)胞群體技術(shù)。（克隆培養(yǎng)與群體培養(yǎng)是一種等位概念）2、特性：純系（遺傳性狀均一、體現(xiàn)性狀相同）3、基本要求：必須確保分離出來細(xì)胞是一種而不是多種。4、克隆難易程度:單細(xì)胞不如群體細(xì)胞原代細(xì)胞、有限細(xì)胞系＜連續(xù)細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化或腫瘤細(xì)胞5、提升克隆形成率措施：選擇合適培養(yǎng)基、添加血清（胎牛血清）、滋養(yǎng)細(xì)胞（如經(jīng)射線照射本身是去增值力小鼠成纖維細(xì)胞）、激素（胰島素等）刺激、CO2培養(yǎng)箱、調(diào)整PH值等6、用途：如從一般細(xì)胞系中分離出缺乏特殊基因突變細(xì)胞系。第22頁三、動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)及其應(yīng)用★

什么是細(xì)胞融合技術(shù)？★

為何要進(jìn)行細(xì)胞融合？★

如何實(shí)現(xiàn)細(xì)胞融合？第23頁

定義

指用自然或人工辦法,使兩個(gè)或多種不一樣細(xì)胞融合成一種細(xì)胞過程。

不一樣基因型細(xì)胞之間融合就是細(xì)胞雜交。1、動(dòng)物細(xì)胞融合受精作用兩個(gè)細(xì)胞正在融合第24頁

誘導(dǎo)融合原因生物法：滅活仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)融合利用滅活仙臺(tái)病毒是動(dòng)物細(xì)胞融合所特有。這是由于病毒磷脂外衣與動(dòng)物細(xì)胞膜十分相同緣故。病毒外殼上某些糖蛋白也許尚有促進(jìn)細(xì)胞融合功能。化學(xué)法：聚乙二醇誘導(dǎo)融合由于聚乙二醇易得、簡便，且融合效果穩(wěn)定，是目前應(yīng)用最廣泛辦法。物理法：電刺激誘導(dǎo)融合病毒顆粒黏附細(xì)胞表面細(xì)胞膜連接細(xì)胞膜被病毒顆粒穿通細(xì)胞融合、形成雜種細(xì)胞第25頁5、應(yīng)用1.由于細(xì)胞雜交中染色體容易丟失，因此利用雜交細(xì)胞檢測特定染色體丟失與特定基因產(chǎn)物減少對應(yīng)關(guān)系，能夠進(jìn)行基因定位。3.利用雜交瘤技術(shù)，制備單克隆抗體。2.克服遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙鼠—雞、鼠—兔、鼠—猴、人—鼠、人—兔、人—雞、人—蛙、酵母菌—雞、人—胡蘿卜等此技術(shù)有什么缺陷和長處？第26頁小鼠單克隆抗體制備第27頁雜交瘤制備融合前準(zhǔn)備工作細(xì)胞融合雜交瘤細(xì)胞篩選單克隆抗體大量制備第28頁主要設(shè)備

凈化工作臺(tái)

超凈工作臺(tái)是一種無菌操作裝置，其原理是內(nèi)設(shè)鼓風(fēng)機(jī)，驅(qū)動(dòng)空氣通過高效濾器凈化后，讓凈化后空氣漸漸通過臺(tái)面空間，使工作場地組成無菌環(huán)境。組織培養(yǎng)材料準(zhǔn)備第29頁主要設(shè)備

CO2恒溫培養(yǎng)箱

骨髓瘤和雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)都需要在恒定溫度條件下才能生存，溫度變化一般不應(yīng)超出0.5度。因此要求培養(yǎng)箱應(yīng)具有較高敏捷度；電熱恒溫箱質(zhì)量關(guān)鍵在于控溫裝置優(yōu)劣。CO2恒溫培養(yǎng)箱已成為普遍應(yīng)用設(shè)備，長處是箱內(nèi)能恒定地提供一定量二氧化碳，一般用5%，可使培養(yǎng)液維持穩(wěn)定pH，減少調(diào)pH麻煩。組織培養(yǎng)材料準(zhǔn)備第30頁主要設(shè)備

離心機(jī)培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)常需要制備細(xì)胞懸液、漂洗，需離心分離細(xì)胞，要求每分1000轉(zhuǎn)左右，故一般小型臺(tái)式離心機(jī)即符合要求。組織培養(yǎng)材料準(zhǔn)備第31頁主要設(shè)備

培養(yǎng)液過濾裝置

多種培養(yǎng)用液只能用過濾辦法進(jìn)行除菌做消毒處理?，F(xiàn)多用微孔濾膜，密度有不一樣型號(hào)，尺寸有不一樣規(guī)格。組織培養(yǎng)材料準(zhǔn)備第32頁主要設(shè)備

多孔培養(yǎng)板、塑料器皿

組織培養(yǎng)材料準(zhǔn)備第33頁骨髓瘤細(xì)胞懸液制備骨髓瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)50ml離心管1000r/min離心5-10min離心洗滌骨髓瘤細(xì)胞懸液活細(xì)胞計(jì)數(shù)后備用融合前48-36h融合當(dāng)天30ml不完全培養(yǎng)基10ml不完全培養(yǎng)基0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液

第34頁脾細(xì)胞懸液制備小鼠脾臟直徑10cm平皿剝離周圍結(jié)締組織

剪刀剪碎、注射器芯擠壓單細(xì)胞懸液直徑10cm平皿10ml不完全培養(yǎng)基

銅網(wǎng)過濾

10ml不完全培養(yǎng)基

輕輕洗滌

第35頁脾細(xì)胞懸液制備脾細(xì)胞懸液1000r/min離心5-10min離心洗滌1-2次脾細(xì)胞懸液活細(xì)胞計(jì)數(shù)后備用50ml不完全培養(yǎng)基10ml不完全培養(yǎng)基0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液

第36頁1234mmmm12341234單克隆抗體細(xì)胞融合取出脾細(xì)胞+癌細(xì)胞各抗體分開傳統(tǒng)抗血清抗原免疫所有抗體混合123412341234B細(xì)胞抗原免疫小鼠后，其脾臟會(huì)產(chǎn)生分泌抗體多種B細(xì)胞。每種B細(xì)胞只能分泌一種抗體，反抗各自抗原決定基。傳統(tǒng)抗血清便是所有抗體混合，得以有效保護(hù)動(dòng)物個(gè)體。假如能夠把單一種B細(xì)胞挑出來培養(yǎng)，則可收獲單一種抗體。不過，B細(xì)胞無法在試管中培養(yǎng)生長。癌細(xì)胞可以在試管中連續(xù)培養(yǎng)生長，但無法產(chǎn)生所要抗體。這些單獨(dú)融合細(xì)胞能夠大量生產(chǎn)單獨(dú)一種抗體，就是單克隆抗體。若把B細(xì)胞與癌細(xì)胞融合，所得到融合細(xì)胞則可分別培養(yǎng)。第37頁骨髓瘤細(xì)胞致敏B淋巴細(xì)胞雜交瘤第38頁骨髓瘤細(xì)胞脾細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞融合后細(xì)胞類型:

雜交瘤技術(shù)理論基礎(chǔ)融合細(xì)胞篩選技術(shù)第39頁融合細(xì)胞篩選技術(shù)生化代謝缺陷型骨髓瘤細(xì)胞系單克隆抗體產(chǎn)生原理HAT培養(yǎng)基根據(jù)篩選雜交瘤細(xì)胞特殊培養(yǎng)液。

第40頁融合后細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中存活情況不能長期生長死亡生化代謝正常能夠長期生長生長繁殖死亡生化代謝缺陷能夠長期生長生化代謝正常第41頁雜交瘤細(xì)胞篩選

脾細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞融合HAT初步篩選篩選陽性克隆單克隆抗體產(chǎn)生原理第42頁操作步驟篩選陽性細(xì)胞克隆每孔加待檢雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，同步設(shè)置陽性（免疫鼠血清）、陰性對照（完全培養(yǎng)基）和空白對照。第43頁單克隆抗體大量制備動(dòng)物體內(nèi)生產(chǎn)法體外培養(yǎng)法小鼠腹水誘導(dǎo)細(xì)胞培養(yǎng)液第44頁制備雜交瘤培養(yǎng)上清

雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)增1:10百分比轉(zhuǎn)入新瓶離心、搜集上清檢測抗體滴度分裝、無菌保存

37℃5％CO2

5d

第45頁制備單克隆抗體腹水

動(dòng)物體內(nèi)生產(chǎn)單抗是最實(shí)用大量制備單抗辦法。使用動(dòng)物首選BALB/c小鼠。原理：將雜交瘤細(xì)胞接種于小鼠腹腔內(nèi)，在小鼠腹腔內(nèi)生長雜交瘤，并產(chǎn)生腹水，因而可得到大量腹水單抗且抗體濃度很高。注射細(xì)胞前一般先用降植烷或液體石蠟處理腹腔，方便產(chǎn)生大量腹水。缺陷：腹水中?；煊行∈蠖喾N雜蛋白（包括Ig）；有污染動(dòng)物病毒危險(xiǎn)。第46頁制備單克隆抗體腹水

腹腔接種降植烷或液體石蠟（0.5-1ml/只）

7-10天腹腔接種無血清培養(yǎng)基稀釋雜交瘤細(xì)胞，5×105/只

第47頁制備單克隆抗體腹水

7-10天采集腹水2023r/min，5min搜集上清，測定抗體效價(jià)分裝，凍存?zhèn)溆?/p>

第48頁第49頁思考：（1）為何用小鼠骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合？

細(xì)胞同源性越近，融合形成雜種細(xì)胞越易成活。繼承了雙親細(xì)胞遺傳物質(zhì)，不但具有B細(xì)胞分泌抗體能力，并且尚有沒有限增殖本事，因而能夠取得大量單克隆抗體。（2）骨髓瘤細(xì)胞是癌細(xì)胞嗎？有沒有限增殖能力細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞，而具有轉(zhuǎn)移能力腫瘤細(xì)胞，稱為癌細(xì)胞，因此瘤細(xì)胞不能等同于癌細(xì)胞。（3）制備過程為何要通過兩次篩選？

第一次篩選取得多種雜交瘤細(xì)胞第二次篩選出特異抗體雜交瘤細(xì)胞。(5)本過程利用了哪些原理？免疫原理、細(xì)胞融合原理、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)原理（4）制備過程中應(yīng)用哪些細(xì)胞工程技術(shù)伎倆？

細(xì)胞融合技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。第50頁動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有雜交瘤細(xì)胞才能活動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)取得產(chǎn)生對應(yīng)抗體B淋巴細(xì)胞取得能產(chǎn)生所需抗體雜交瘤細(xì)胞取得雜交瘤細(xì)胞第51頁1975年，米爾斯坦（英）和科勒（德）融合選擇性培養(yǎng)基抗體檢測問題探究1.第一次篩選和第二次篩選目標(biāo)有何不一樣？2.單克隆抗體有何特點(diǎn)？單克隆抗體長處：化學(xué)性質(zhì)單一，特異性強(qiáng)，敏捷度高。第一次篩選：用選擇性培養(yǎng)基取得雜交瘤細(xì)胞。第二次篩選：通過抗體檢測取得能產(chǎn)生所需抗體雜交瘤細(xì)胞。第52頁四、動(dòng)物克隆繁殖★理論上，分化動(dòng)物細(xì)胞能像植物細(xì)胞同樣脫分化、再分化成一種動(dòng)物體嗎？★動(dòng)物細(xì)胞事實(shí)上體現(xiàn)出全能性情況如何呢？第53頁受精卵>胚胎干細(xì)胞>多能干細(xì)胞>單能干細(xì)胞>體細(xì)胞四、動(dòng)物克隆繁殖（一）動(dòng)物細(xì)胞全能性體現(xiàn)程度如多能造血干細(xì)胞：可分化為紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板等（2）低等動(dòng)物細(xì)胞：全能性一般容易體現(xiàn)。如水螅上皮細(xì)胞，不通過度裂就能夠轉(zhuǎn)變?yōu)樯掀?、肌肉?xì)胞。（1）高等動(dòng)物細(xì)胞第54頁（二）動(dòng)物難以克隆主線原因

在動(dòng)物個(gè)體發(fā)育過程中，分化成果使得細(xì)胞在形態(tài)和功能上高度特化，這是由于細(xì)胞在伴伴隨它們發(fā)育過程中在時(shí)間、空間變化，基因體現(xiàn)調(diào)控使得細(xì)胞中合成了專一蛋白質(zhì)。動(dòng)物基因組中，一類基因是維持生存，在多種細(xì)胞中都處于活動(dòng)狀態(tài)。另一類基因伴隨組織器官和發(fā)育階段不一樣而選擇性體現(xiàn)。分化細(xì)胞內(nèi)基因活動(dòng)很不完全，因此很難像受精卵那樣發(fā)揮細(xì)胞全能性。第55頁胚胎細(xì)胞核移植成功率遠(yuǎn)高于成體細(xì)胞(三)細(xì)胞核移植試驗(yàn)和動(dòng)物克隆繁殖1、過程：利用一種細(xì)胞細(xì)胞和來取代另一細(xì)胞中細(xì)胞核，形成一種重建“合子”胚胎細(xì)胞核移植體細(xì)胞核移植第56頁綿羊“多莉”克隆過程：第57頁詳細(xì)操作取6歲母綿羊（芬蘭多塞特白品種綿羊）乳腺細(xì)胞作核供體細(xì)胞，用“饑餓法”使其進(jìn)入休眠狀態(tài)而使所有基因具有活性。注射促性腺激素GN促使母羊（蘇格蘭黑面母綿羊）排卵，28－33小時(shí)取其未受精卵迅速去核，放入10%FCS（小牛血清）、1%FCS和0.5%FCS連續(xù)5天，饑餓使進(jìn)入G0期做受體細(xì)胞。

第58頁在乳腺細(xì)胞與無核卵放入同一培養(yǎng)皿中，在微電流作用下，將乳腺細(xì)胞核融入卵中，形成一種具有新遺傳物質(zhì)卵細(xì)胞。將新卵細(xì)胞發(fā)育成桑椹期胚胎或囊胚，再移入假孕母羊子宮內(nèi)。產(chǎn)下多莉即為6歲母羊復(fù)制品，也為白色。第59頁①供體和受體準(zhǔn)備核移植成功主要前提：盡可能確保核供體和受體細(xì)胞處于同樣細(xì)胞周期（同步狀態(tài)）

如何使處于細(xì)胞周期不一樣階段上核供體和受體處于同步狀態(tài)？第60頁饑餓技術(shù)即在供體細(xì)胞培養(yǎng)基中減少營養(yǎng)物質(zhì)（血清）濃度，使供體細(xì)胞處于“饑餓狀態(tài)”，停頓分裂增殖而休眠。休眠細(xì)胞核進(jìn)入去核卵細(xì)胞后，在卵細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)作用下重新啟動(dòng)分裂程序。這樣，供體細(xì)胞核與受體細(xì)胞質(zhì)才能在分裂相上互相協(xié)調(diào)，配合細(xì)胞才能分裂發(fā)育。第61頁②去卵膜和卵核如何給受體細(xì)胞去核？◆顯微操作

◆紫外照射◆細(xì)胞松弛素結(jié)合高速離心

第62頁第63頁③供體細(xì)胞制備如何獲取供體細(xì)胞核？◆

顯微操作

◆細(xì)胞松弛素結(jié)合高速離心核體胞質(zhì)體第64頁二、克隆技術(shù)辦法將受體卵細(xì)胞

去核向去核卵細(xì)胞植入供體細(xì)胞移植后細(xì)胞激活后能夠象受精卵同樣發(fā)育形成動(dòng)物個(gè)體，并具有與核供體細(xì)胞相同基因④移核第65頁⑤移植后重組細(xì)胞激活、培養(yǎng)、胚胎移植◆激活（P52）（使卵母細(xì)胞從MII期解放，轉(zhuǎn)到“受精”狀態(tài)）◆重組胚體內(nèi)或體外培養(yǎng)◆胚胎移植

第66頁重構(gòu)卵激活正常情況下,受精過程中，精子進(jìn)入卵子后,卵母細(xì)胞質(zhì)中會(huì)出現(xiàn)一系列反應(yīng),如母源性mRNA啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄等。這些反應(yīng)是卵母細(xì)胞被激活標(biāo)志，不通過這些變化,胚胎就不能正常發(fā)育。核移植過程中激活就是模仿受精過程中精子刺激作用。目前，激活方式主要有：電激活和化學(xué)激活第67頁顯微操作法進(jìn)行細(xì)胞核移植第68頁克隆羊成功分子細(xì)胞生物學(xué)機(jī)理：

供體核DNA中有起源于乳腺細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)調(diào)整蛋白，它制止了核基因體現(xiàn)。重組卵細(xì)胞，基因轉(zhuǎn)錄沒開始，無調(diào)整蛋白重組移核細(xì)胞丟失了源于乳腺細(xì)胞調(diào)整蛋白。通過三次分裂后，原乳腺細(xì)胞調(diào)整蛋白便所有被卵細(xì)胞質(zhì)中蛋白因子替代了，因此核DNA被重新編排，細(xì)胞開始體現(xiàn)自己基因。第69頁體細(xì)胞克隆成功意義：1、證明了高度分化細(xì)胞也能夠回復(fù)到類似受

精卵時(shí)期功能。2、證明了細(xì)胞質(zhì)具有調(diào)控細(xì)胞核發(fā)育作用。應(yīng)用：

為遺傳疾病治療、優(yōu)良品種培育等提供了主要途徑；對瀕危動(dòng)物保存也有主要意義?？寺〕晒l件（必備基礎(chǔ)）P201、具有包括物種完整基因組細(xì)胞核活細(xì)胞。(如乳腺上皮細(xì)胞)2、能有效調(diào)控細(xì)胞核發(fā)育細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)。（如去核卵細(xì)胞