湖北省克氏原螯蝦攜帶白斑病病毒的初步調(diào)查

湖北省克氏原螯蝦攜帶白斑病病毒的初步調(diào)查

0養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的病害與損害克氏原始錨狀蝦屬于甲殼類、甲殼類、頭狀腦、下葉蝦和前葉蝦科。它是中國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖品種。近年來(lái),克氏原螯蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速,其產(chǎn)量從2007年的26.55萬(wàn)t到2016年85.23萬(wàn)t,呈現(xiàn)了逐年上升的趨勢(shì)。其中,湖北省2016年克氏原螯蝦的總產(chǎn)量達(dá)到了48.9萬(wàn)t,占到了全國(guó)總產(chǎn)量的57.4%,名列全國(guó)第一。在2016年全國(guó)小龍蝦各縣市產(chǎn)量排名中,湖北省監(jiān)利縣、洪湖市、潛江市分別以9.72萬(wàn)t,7.47萬(wàn)t,4.58萬(wàn)t排名前三位?？耸显r以其豐富的蛋白營(yíng)養(yǎng)、鮮艷的色澤、鮮美的味道獲得了消費(fèi)者的喜愛,推動(dòng)了克氏原螯蝦產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。但是,隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,病害逐漸增加,給養(yǎng)殖業(yè)造成了一定的損失。尤其是近年來(lái)白斑綜合征病毒(WhiteSpotSyndromeVirus,WSSV)的感染給克氏原螯蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了巨大的損失。白斑綜合征病毒,是一種雙鏈桿狀DNA病毒,其核酸為環(huán)狀雙鏈DNA。WSSV屬于新設(shè)立的線極病毒科(Nimaviridae),白斑病毒屬(Whispovirus)的唯一種當(dāng)前,克氏原螯蝦已成為湖北省的特色產(chǎn)業(yè)之一1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1克氏原螯蝦群體發(fā)生率于2016年5月—2017年7月,分別采集了洪湖市、潛江市、鄂州市、隨州市、監(jiān)利縣5個(gè)縣市7個(gè)區(qū)域的克氏原螯蝦群體共計(jì)741個(gè)樣本(表1)。1.1.2蛋白酶k細(xì)胞裂解液[10mmol/LTris-HCl(pH8.0),100mmol/LEDTA(pH8.0),2%SDS],蛋白酶K(ProteinaseK,規(guī)格5mL,濃度≥600mAnsonU/mL),瓊脂糖(規(guī)格100g),dNTPMixture(規(guī)格250μL,10mmol/L)、rtaq酶(包括TaKaRaTaq1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1tsyndr模型根據(jù)Genbank基因數(shù)據(jù)庫(kù)中WSSV[Whitespotsyndromevirus(taxid:342409)]保守序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物VPw-F1/R1,同時(shí)根據(jù)WSSV序列(AF369029)設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物1.2.2離心-實(shí)際樣品的制備取克氏原螯蝦的組織約0.1g于2mL離心管中,向其中加入600μL的細(xì)胞裂解液,用消毒后的小剪刀將組織剪碎后,加入12μL濃度為20mg/mL的蛋白酶K(以上操作均需要在冰上操作),將混合溶液充分混合均勻以后,放入58℃水浴條件下消化2h左右,直到溶液中的組織完全溶解。將消化水解液取出冷卻至室溫,加入200μL濃度為10mol/L的醋酸銨溶液,顛倒混勻2～3min,看到有沉淀產(chǎn)生后,使用高速離心機(jī)在12000r/min離心8min,取上清液至另一個(gè)潔凈的離心管。加入等體積的已經(jīng)在-80℃條件下預(yù)冷15min的異丙醇,顛倒混勻后,使用離心機(jī)12000r/min離心8min,棄去上清液,使用70%乙醇洗滌沉淀2～3次。等到沉淀表面的水分自然干燥后,加入100μL滅菌的雙蒸水溶解,置于冰箱-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?.2.3rtaq酶活性染料ldntps4.分別用3對(duì)引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25μL:10×PCR擴(kuò)增緩沖液(含有鎂離子的buffer)2.5μL;dNTPs0.5μL;引物0.5μL;rTaq酶0.3μL;DNA模板0.3μL,加雙蒸水至總體積為25μL。PCR反應(yīng)的條件為:94℃預(yù)熱變性10min;94℃變性1min,55℃退火1min,72℃延伸2min,共35個(gè)循環(huán);72℃延伸7min。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳觀察記錄結(jié)果。2結(jié)果與分析2.1克氏原螯蝦不同組織取樣效果分析由于攜帶WSSV病毒的克氏原螯蝦患病初期的癥狀不是很明顯,養(yǎng)殖的克氏原螯蝦無(wú)法通過(guò)外觀判別是否攜帶WSSV病毒。需要通過(guò)PCR手段取組織樣品進(jìn)行檢測(cè)。為了保證取樣后克氏原螯蝦仍然可以存活,比較了不同的組織取樣效果,以確定克氏原螯蝦最佳的WSSV病毒檢測(cè)組織,分別取9只克氏原螯蝦的觸角、螯肢、附肢、游泳足、尾扇5種組織,比較了WSSV的檢測(cè)結(jié)果(圖1,表3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),剪取附肢對(duì)克氏原螯蝦的損傷最小,且檢測(cè)效果亦較好。而取螯肢組織、游泳足組織對(duì)克氏原螯蝦損傷較大,觸角組織、游泳足組織、尾扇的肌肉組織含量較低,需要的取樣量比較大,對(duì)克氏原螯蝦的損傷亦比較大。2.2wssv攜帶情況對(duì)湖北省潛江市新溝鎮(zhèn)、監(jiān)利縣汴河鎮(zhèn)、洪湖市新堤、洪湖市螺山鎮(zhèn)、隨州市長(zhǎng)崗鎮(zhèn)、鄂州市澤林鎮(zhèn)和鄂州市杜山鎮(zhèn)等地的克氏原螯蝦樣品741份進(jìn)行檢測(cè),調(diào)查這些養(yǎng)殖區(qū)域克氏原螯蝦WSSV病毒的攜帶情況,結(jié)果顯示潛江市新溝鎮(zhèn)克氏原螯蝦WSSV攜帶率為68%,監(jiān)利縣汴河鎮(zhèn)為66.7%,洪湖市新堤克氏原螯蝦為67.8%,洪湖市螺山鎮(zhèn)為44.7%,隨州市長(zhǎng)崗鎮(zhèn)為40.4%,鄂州市澤林鎮(zhèn)為37.7%,鄂州市杜山鎮(zhèn)為39.1%(圖2,圖3)。2.3wssv的測(cè)序序列及系統(tǒng)發(fā)育樹選取各地WSSV陽(yáng)性樣品中的49個(gè)樣品(表1),采用Ow-F1/Ow-R1引物擴(kuò)增的序列進(jìn)行測(cè)序分析。分別將49個(gè)樣品PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果序列中截取的1100bp的可信區(qū)間內(nèi)互相分析比對(duì),發(fā)現(xiàn)這些保守序列有1個(gè)堿基變異位點(diǎn)A/T,位于1100bp序列上第1062位(圖4)。在1100bp中第1062位堿基為A的個(gè)體樣本個(gè)數(shù)有12個(gè),為ZL1、XG8、XG7、XG6、XG5、LS4、LS2、BH3、BH2、DS4、CG9和CG8。在1100bp序列中堿基為T的個(gè)體樣本個(gè)數(shù)有37個(gè),為XD1、XD2、XD3、XD4、XD5、XD6、XD7、XD8、XD9、XD10、ZL2、ZL9、ZL10、XG1、XG4、LS3、LS5、LS6、LS8、LS9、LS10、BH9、BH8、BH7、BH6、BH5、BH10、BH1、DS2、DS1、CG7、CG5、CG3、CG2、CG10、CG1和CG6。翻譯成蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析比對(duì),結(jié)果未發(fā)現(xiàn)有氨基酸序列變異。在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn),變異位點(diǎn)處堿基為T的1100bp的測(cè)序序列與NCBI上已經(jīng)測(cè)得WSSV全基因組的5種中國(guó)大陸株(AF332093、KY827813、KT995472、KT995471、KT995470)、埃及株(KR083866)、泰國(guó)株(AF369029)以及中國(guó)臺(tái)灣株(AF440570)相似度達(dá)到100%,而堿基發(fā)生變異為A的1100bp的測(cè)序序列,由于一個(gè)堿基的突變,與以上序列的相似度為99%。在NCBI上以1100bp的測(cè)序片段通過(guò)Blast比對(duì),得到17條長(zhǎng)度為1100bp的堿基序列。采用MEGA6.0軟件將這17個(gè)序列與49個(gè)樣品的測(cè)序結(jié)果以Jukes-Cantor模型的最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行分析(圖5)。從圖5的結(jié)果看,系統(tǒng)發(fā)育樹大致分為7支,其中,長(zhǎng)崗鎮(zhèn)樣品測(cè)序兩個(gè)樣品中編號(hào)CG6的測(cè)序序列和CG1的測(cè)序序列、越南株(JX564899)和韓國(guó)株(JX515788)4個(gè)序列分別單獨(dú)構(gòu)成一支;澤林鎮(zhèn)樣品ZL1、新溝鎮(zhèn)樣品XG5、XG6、XG7、XG8、螺山鎮(zhèn)2個(gè)樣品LS2、LS4、汴河鎮(zhèn)樣品BH2、BH3、杜山鎮(zhèn)樣品DS4以及長(zhǎng)崗鎮(zhèn)樣品CG8、CG9共12條序列聚為一支,中國(guó)臺(tái)灣株(U50923、AF440570)、韓國(guó)株(AF361753)、泰國(guó)株(AF369029)、伊朗株(KF032716)、孟加拉國(guó)株(KJ773998)、中國(guó)大陸株(AF332093、KT995470、KT995471、KT995472、KY827813)、埃及株(KR083866)、墨西哥株(KU216744)共13條序列聚為一支;澳大利亞株(MF161441)、孟加拉株(KJ719075)與其他35個(gè)樣品測(cè)序序列匯聚為一支。3討論3.1wssv檢測(cè)組織通過(guò)比較不同組織提取DNA檢測(cè)WSSV病毒的PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)觸角、螯肢、附肢、游泳足、尾扇等5種組織都可以作為WSSV檢測(cè)的取樣組織,其中螯肢、附肢的檢測(cè)效果較好,觸角,游泳足,尾扇由于肌肉含量相對(duì)較低,需要取下大量組織用于檢測(cè)。然而,要保證檢測(cè)后的克氏原螯蝦繼續(xù)存活,取附肢組織作為檢測(cè)該病毒的組織較為妥當(dāng)。朱斐3.2攜帶wssv的克氏原螯蝦個(gè)體診斷WSSV在感染過(guò)程中具有潛伏期。通過(guò)對(duì)湖北省7個(gè)克氏原螯蝦主要養(yǎng)殖地區(qū)的WSSV攜帶情況調(diào)查發(fā)現(xiàn),湖北省克氏原螯蝦幾個(gè)主要養(yǎng)殖區(qū)域克氏原螯蝦個(gè)體攜帶WSSV比例約40%～70%,大部分?jǐn)y帶WSSV個(gè)體尚未發(fā)病,很難通過(guò)肉眼診斷或者觀察病灶等常規(guī)診斷方法判斷出來(lái)。由此,推測(cè)WSSV在克氏原螯蝦感染過(guò)程中是一種條件致病病毒,感染個(gè)體只有在環(huán)境脅迫達(dá)到一定程度下,才會(huì)引發(fā)病毒在體內(nèi)的急劇增值,從而導(dǎo)致發(fā)病。朱斐等3.3堿基突變對(duì)克氏原螯蝦群體的影響楊星等通過(guò)MEGA6.0對(duì)49條測(cè)序獲得的1100bp的序列與NCBI上17條已知全長(zhǎng)的WSSV序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)構(gòu)來(lái)看,此次采集樣品的7個(gè)主要養(yǎng)殖區(qū)域克氏原螯蝦群體中發(fā)生堿基A/T突變的群體與17個(gè)已公布的WSSV地區(qū)亞種的關(guān)系都比較遠(yuǎn),而未發(fā)生A/T堿基突變的大部分群體與澳大利亞株(MF161441)、孟加拉株(KJ719075)親緣關(guān)系更近。在NCBI的基因序列注釋上,這條1100bp的WSSV序列屬于一條長(zhǎng)度為18234bp的WSSV360基因片段的一部分,編碼的是含有6077個(gè)氨基酸蛋白VP664,它位于WSSV核蛋白殼內(nèi),是目前在病毒中發(fā)現(xiàn)的分子量最大的蛋白3.4wssv在克氏原螯蝦群體中可能的傳播情況本次實(shí)驗(yàn)中采集的741只克氏原螯蝦樣本中有391只檢測(cè)到WSSV病毒,陽(yáng)性率平均為52.77%,說(shuō)明克氏原螯蝦的WSSV感染源在這幾個(gè)養(yǎng)殖區(qū)域可能廣泛地存在?？耸显rWSSV的流行病學(xué)調(diào)查證實(shí),通過(guò)食物鏈和自相殘食進(jìn)入宿主消化道是WSSV的主要感染和傳播途徑4wssv的傳播途徑綜上所述,在進(jìn)行WSSV檢測(cè)時(shí),選取克氏原螯蝦附肢作為檢測(cè)取樣組織,對(duì)其損傷較小;湖北省幾個(gè)地區(qū)的741只克氏原螯蝦樣本中有391只檢測(cè)到WSSV病毒,陽(yáng)性率平均為52.77%,WSSV攜帶比率較高。通過(guò)測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),發(fā)生堿基A/T突變的WSSV與17個(gè)已公布的WSSV地區(qū)亞種的親緣關(guān)系都比較遠(yuǎn),而未發(fā)生A/T堿基突變的WSSV與澳大利亞株(MF161441)、孟加拉株(KJ719075)親緣關(guān)系更近。WSSV在克氏原螯蝦養(yǎng)殖過(guò)程中傳播途徑廣泛,未來(lái)只有對(duì)WSSV傳播的各個(gè)渠道進(jìn)行監(jiān)控,切斷可能的傳播途徑,才能實(shí)現(xiàn)對(duì)WSSV病害進(jìn)行有效的防控。水浴鍋(型號(hào):HW.SY21-KP4)由北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司生產(chǎn);高速離心機(jī)(型號(hào)TG16-W)由湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司生產(chǎn);凝膠成像系統(tǒng)及分析軟件(型號(hào)Che