質(zhì)粒DNA的提取、純化和電泳檢測(cè)

質(zhì)粒DNA的提取、純化和電泳檢測(cè)姓名學(xué)號(hào)同組人班級(jí)實(shí)驗(yàn)時(shí)間摘要：質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞中與主染色體共存、可自主復(fù)制的一段大多數(shù)呈環(huán)形的DNA，它是基因工程中一種非常重要的載體。質(zhì)粒DNA的提取成為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室一項(xiàng)最基本的工作。堿變性提取法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法。電泳是帶電物質(zhì)在電場(chǎng)中向著與其電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。凝膠電泳可用于分離、鑒定和純化DNA片段，是分子生物學(xué)的核心技術(shù)之一。本次實(shí)驗(yàn)利用堿變法對(duì)E.coliDH5受體菌中質(zhì)粒pUC19的DNA進(jìn)行提取、純化和電泳檢測(cè)，旨在學(xué)習(xí)并掌握質(zhì)粒DNA提取的原理、純化及瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。通過(guò)此次實(shí)驗(yàn)，我們達(dá)到了預(yù)期效果。關(guān)鍵詞：質(zhì)粒DNA、堿變性提取法、質(zhì)粒DNA的純化、DNA凝膠電泳1.引言質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞中與主染色體共存、可自主復(fù)制的一段大多數(shù)呈環(huán)形的DNA。細(xì)菌質(zhì)粒的相對(duì)分子質(zhì)量大小從1kb至200kb以上不等。一些質(zhì)粒永遠(yuǎn)獨(dú)立于染色體之外，另外一些質(zhì)粒在一定條件下會(huì)可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過(guò)細(xì)胞分裂傳遞到后代。質(zhì)粒在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。目前，已發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒的細(xì)菌有幾百種，已知的絕大多數(shù)的細(xì)菌質(zhì)粒都是閉合環(huán)狀DNA分子（簡(jiǎn)稱cccDNA）。由于質(zhì)粒分子小、便于分離和提取的特點(diǎn)，在DNA重組中，質(zhì)粒或經(jīng)過(guò)改造后的質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)連接外源基因構(gòu)成重組體，攜帶目的基因進(jìn)入細(xì)菌、動(dòng)物細(xì)胞或植物體內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增與表達(dá)，因此質(zhì)粒是基因工程中一種非常重要的載體。質(zhì)粒特征的分析已被廣泛用于細(xì)菌種屬鑒定、耐藥性、毒力及同源性分析。近年來(lái)由于基因芯片技術(shù)的出現(xiàn)，質(zhì)?；蛱结樀拈_發(fā)和應(yīng)用也得到了飛速的發(fā)展，所以這就要求我們從宿主細(xì)胞中提取高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA。因此，質(zhì)粒DNA的提取成為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室一項(xiàng)最基本的工作。提取和純化質(zhì)粒DNA的方法很多，目前常用的有：堿裂解/堿變性法、煮沸法、羥基磷灰石柱層析法、EB-氯化銫密度梯度離心法和Wizard法等。其中，堿變性提取法最為經(jīng)典和常用，是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的，適用于不同量質(zhì)粒DNA的提取。該方法操作簡(jiǎn)單，易于操作，一般實(shí)驗(yàn)室均可進(jìn)行。提取的質(zhì)粒DNA純度高，可直接用于酶切、序列測(cè)定及分析。堿變性提取質(zhì)粒DNA一般包括三個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞以擴(kuò)增質(zhì)粒；收集和裂解細(xì)胞；分離和純化質(zhì)粒DNA。在細(xì)菌細(xì)胞中，染色體DNA以雙螺旋結(jié)構(gòu)存在，質(zhì)粒DNA以共價(jià)閉合環(huán)狀形式存在。細(xì)胞破碎后，染色體DNA和質(zhì)粒DNA均被釋放出來(lái)，但是兩者變性與復(fù)性所依賴的溶pH值不同。在pH12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性；質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離。當(dāng)用pH值4.8的KAc（或NaAc）高鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)堿性溶液至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA可恢復(fù)原來(lái)的共價(jià)閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)而溶解于溶液中；但染色體DNA不能復(fù)性，而是與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起形成纏連的、可見的白色絮狀沉淀。這種沉淀通過(guò)離心，與復(fù)性的溶于溶液的質(zhì)粒DNA分離。溶于上清液的質(zhì)粒DNA，可用無(wú)水乙醇和鹽溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA和RNA性質(zhì)類似，乙醇沉淀DNA的同時(shí)，也伴隨著RNA沉淀，可利用RNaseA將RNA降解。質(zhì)粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通過(guò)酚/氯仿抽提除去，最后獲得純度較高的質(zhì)粒DNA。電泳是帶電物質(zhì)在電場(chǎng)中向著與其電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。各種生物大分子在一定pH條件下，可以解離成帶電荷的離子，在電場(chǎng)中會(huì)向相反的電極移動(dòng)。凝膠是支持電泳介質(zhì)，它具有分子篩效應(yīng)。含有電解液的凝膠在電場(chǎng)中，其中的電離子會(huì)發(fā)生移動(dòng)，移動(dòng)的速度可因帶電離子的大小、形態(tài)及電荷量的不同而有差異。利用移動(dòng)速度差異，就可以區(qū)別各種大小不同的分子。因而，凝膠電泳可用于分離、鑒定和純化DNA片段，是分子生物學(xué)的核心技術(shù)之一。凝膠電泳技術(shù)操作簡(jiǎn)單而迅速，分辨率高，分辨范圍極廣。此外，凝膠中DNA的位置可以用低濃度熒光插入染料如EB染色直接觀察到，甚至含量少至20pg的雙鏈DNA在紫外激發(fā)下也能直接檢測(cè)到。溴化乙錠（EB）是一種具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的堿基之間，并在300nm波長(zhǎng)的紫外光照射下放射出熒光，所以可用來(lái)顯現(xiàn)凝膠中的核酸分子。在適當(dāng)?shù)娜旧珬l件下，熒光的強(qiáng)度是同DNA片段的大小（或數(shù)量）成正比。核酸在溶液中由于磷酸基而帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳遷移速率主要取決于下面六個(gè)因素：（1）樣品DNA分子的大?。弘娪緯r(shí)，線性雙螺旋DNA分子是以頭尾位向前遷移的，其遷移速度與分子量（所含堿基）的對(duì)數(shù)值成反比，這是因?yàn)榇蠓肿佑懈蟮哪Σ磷枇Α＃?）DNA分子的構(gòu)象：分子量相同而構(gòu)象不同的DNA分子，其遷移速率不同。在抽提質(zhì)粒DNA過(guò)程中，由于各種因素的影響，使超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒DNA（cccDNA）的一條鏈斷裂，變成開環(huán)DNA（ocDNA）分子，如果兩條鏈發(fā)生斷裂，就轉(zhuǎn)變?yōu)榫€狀DNA（LinerDNA）分子。這三種構(gòu)型的分子有不同的遷移率。一般情況下，超螺旋型（cccDNA）遷移速度最快，其次為線狀分子，最慢的是開環(huán)狀（ocDNA）分子。（3）瓊脂糖濃度：瓊脂糖濃度直接影響凝膠的孔徑，一定大小的DNA片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的泳動(dòng)速度不同。通常凝膠濃度愈低，則凝膠孔徑愈大，DNA電泳遷移速度越快，即分子量越大，選用的凝膠濃度應(yīng)越小。（4）電泳所用電場(chǎng)：低電壓條件下，線性DNA片段的遷移速率與所用電壓成正比。電壓愈高帶電顆粒泳動(dòng)愈快，但隨著電場(chǎng)強(qiáng)度增加，高分子量DNA的泳動(dòng)速率以不同幅度增加，因此凝膠電泳分離DNA的有效范圍隨著電壓上升而減小，為了獲得DNA片段的最佳分離效果，電場(chǎng)強(qiáng)度應(yīng)小于5V/cm。（5）電泳緩沖液:在進(jìn)行分子電泳時(shí)所使用的緩沖溶液，用以穩(wěn)定體系酸堿度。常見的核酸電泳緩沖液有：TAE、TBE、TPE和MOPS等。電泳緩沖液的作用：①維持合適的pH。電泳時(shí)，正極發(fā)生氧化反應(yīng)（4OH-+4e-→2H2O+O2），負(fù)極發(fā)生還原反應(yīng)（4H++4e-→2H2），長(zhǎng)時(shí)間的電泳將使正極變酸，負(fù)極變堿。一個(gè)好的緩沖系統(tǒng)應(yīng)有較強(qiáng)的緩沖能力，使溶液兩極的pH保持基本不變；②使溶液具有一定的導(dǎo)電性，以利于DNA分子的遷移，例如，一般電泳緩沖液中應(yīng)含有0.01～0.04mol/L的Na+離子，Na+離子的濃度太低時(shí)電泳速度變慢；太高時(shí)就會(huì)造成過(guò)大的電流使膠發(fā)熱甚至熔化；③電泳緩沖液還有一個(gè)組分是EDTA，加入濃度為1～2mM，目的是螯合Mg2+等離子，防止電泳時(shí)激活DNA酶，此外還可防止Mg2+離子與核酸生成沉淀。電泳緩沖液的組成和離子強(qiáng)度直接影響遷移率，當(dāng)電泳液為無(wú)離子水（如不慎在凝膠中忘記加緩沖液，即誤用蒸餾水配置凝膠），溶液的導(dǎo)電性很少，帶電顆粒泳動(dòng)很慢，DNA幾乎不移動(dòng)；而在高離子強(qiáng)度下（如錯(cuò)用10×電泳緩沖液），導(dǎo)電性極高，帶電顆粒泳動(dòng)很快，產(chǎn)生大量的熱，有時(shí)甚至熔化凝膠或使DNA變性。（6）溫度：DNA在瓊脂糖凝膠電泳中的行為受堿基組成和凝膠溫度影響不明顯。不同大小DNA片段的相對(duì)電泳遷移率在4～30℃內(nèi)無(wú)變化，一般瓊脂糖凝膠電泳多在室溫下進(jìn)行，而當(dāng)瓊脂糖含量少于0.5％時(shí)凝膠很脆弱，最好在4℃下電泳以增加凝膠強(qiáng)度。泳道123456789樣品超螺旋markerpUC19pUC19/HindⅢ1組DNA樣品2組DNA樣品3組DNA樣品4組DNA樣品5組DNA樣品超螺旋marker樣量6μL5μL5μL5μL5μL5μL5μL5μL6μL泳道1011121314151617樣品6組DNA樣品6組DNA樣品（對(duì)照組）7組DNA樣品8組DNA樣品9組DNA樣品10組DNA樣品pUC19/HindⅢpUC19樣量5μL5μL5μL5μL5μL5μL5μL5μL3.結(jié)果在堿裂解/變性法提取質(zhì)粒DNA中，W1為14.16g，W2為14.26g，W2-W1為100mg。堿裂解法提取質(zhì)粒pUC19DNA的瓊脂糖凝膠電泳得到的條帶情況如圖一所示。在溶液中，由于DNA核酸有磷酸基而帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。圖上方是17個(gè)點(diǎn)樣孔，DNA條帶離點(diǎn)樣孔越遠(yuǎn)，說(shuō)明DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳遷移速率越快。圖圖1.堿裂解法提取質(zhì)粒pUC19DNA的瓊脂糖凝膠電泳1234567891011121314151617bp3,0492,087 圖2圖2.SupercoiledDNALadderMarker的DNA條帶泳道1與泳道9加的樣品是SupercoiledDNALadderMarker。SupercoiledDNALadderMarker由8種超螺旋的質(zhì)粒DNA構(gòu)成，DNA大小分別為：2,087bp、3,049bp、3,997bp、5,026bp、6,133bp、8,023bp、10,085bp、11,849bp（如圖2所示）。其中2kbp～6kbp間約以1kbp遞增，6kbp～12kbp間約以2kbp遞增。每次取6μL電泳時(shí)，每條帶的DNA量約為50ng，其中5kbp條帶的DNA量約為其他條帶的3倍（150ng），顯示亮帶。此DNA溶液中已含有1×LoadingBuffer，可直接上樣。1×LoadingBuffer中含有色素XyleneCyanolFF（0.01%）以及BromophenolBlue（0.01%）。在圖1中SupercoiledDNALadderMarker形成的DNA條帶中，可以清晰地看清從下往上6條DNA條帶（對(duì)應(yīng)的DNA由小到大），而且從下往上數(shù)第4條DNA條帶（DNA大小為5026bp）最明亮，而其余2條位置靠上（DNA較大）的DNA條帶較不明顯。泳道2與泳道17加的樣品是質(zhì)粒DNA，即pUC19，可以起到對(duì)照作用。pUC19的DNA是cccDNA，即超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒DNA。在圖1中，可以看到泳道2與泳道17對(duì)應(yīng)的電泳圖中有一條清晰明亮的DNA條帶。泳道3與泳道16加的樣品是pUC19/HindⅢ。HindⅢ是限制性核酸內(nèi)切酶，可以酶切pUC19。HindⅢ酶切pUC19的結(jié)果是使超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的pUC19質(zhì)粒DNA的鏈斷裂，DNA的鏈斷裂的pUC19遷移速度變慢。但是HindⅢ沒(méi)有將所有pUC19酶切，因此泳道3與泳道16電泳后會(huì)形成兩條條帶。在泳道3與泳道16對(duì)應(yīng)的DNA帶中，圖中上面那條較細(xì)較暗的條帶是HindⅢ酶切后的pUC19，圖中下面那條較粗較亮的條帶是沒(méi)有被HindⅢ酶切的pUC19。泳道4加的樣品是1組DNA樣品。其DNA條帶很明亮而且寬。這說(shuō)明1組樣品中DNA含量較高。泳道5加的樣品是2組DNA樣品，可以看見一條較暗的pUC19DNA條帶。另外泳道11對(duì)應(yīng)的電泳圖中也可以看到一條較暗的pUC19DNA條帶。在pUC19對(duì)應(yīng)的DNA條帶位置處全班10個(gè)組均無(wú)明顯的DNA條帶。泳道6加的樣品是我們組（3組）DNA樣品。我們的DNA帶較明亮，說(shuō)明提取出的DNA較多。但DNA條帶位置沒(méi)有在pUC19DNA對(duì)應(yīng)的位置。我們組DNA條帶位置比pUC19DNA對(duì)應(yīng)的條帶位置靠下，說(shuō)明我們組DNA遷移距離比pUC19DNA大，我們組DNA的相對(duì)分子質(zhì)量比pUC19DNA小。在pUC19DNA對(duì)應(yīng)的條帶位置上可以看到模糊的DNA條帶，產(chǎn)生的原因是因?yàn)橄旅娴腄NA條帶中有些DNA因?yàn)檫w移速度較慢而使DNA條帶拉長(zhǎng)。泳道11加的樣品是6組DNA樣品（對(duì)照組）。該樣品在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有用RNA酶處理，其他實(shí)驗(yàn)操作不變。因此該樣品中含有大量的RNA，所以在DNA帶下方形成大片很寬很明亮的RNA區(qū)域。泳道4～泳道8、泳道10～泳道15在電泳圖中都有明顯的拖尾現(xiàn)象，而且在電泳圖泳帶的的中間偏上處都有一條或亮或暗的DNA條帶，這是E.coliDH5受體菌的DNA碎片，DNA碎片相對(duì)分子質(zhì)量較大，泳動(dòng)得較慢，所以形成的DNA條帶較靠上。某些點(diǎn)樣孔的邊緣（尤其是下邊緣）出現(xiàn)熒光，泳道4、泳道7、泳道10、泳道12等對(duì)應(yīng)的點(diǎn)樣孔下邊緣可明顯觀察到此現(xiàn)象。該現(xiàn)象說(shuō)明這些提取的質(zhì)粒DNA中含有較多的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)阻礙了部分DNA泳動(dòng)，從而在點(diǎn)樣孔的邊緣形成熒光。另外在這些點(diǎn)樣孔下邊緣的下方還有一條寬度比點(diǎn)樣孔下邊緣寬的DNA條帶，這是提取的樣品中殘留的E.coliDH5受體菌染色體DNA產(chǎn)生的DNA條帶。4.討論 為獲得高純度的質(zhì)粒DNA，必須徹底去除雜蛋白、染色體DNA和RNA。在整個(gè)質(zhì)粒提取過(guò)程中除去染色體DNA的關(guān)鍵步驟是加入溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的變性和復(fù)性環(huán)節(jié)，應(yīng)控制好變性和復(fù)性的時(shí)機(jī)。溶液Ⅰ中含有50mM葡萄糖、25mMTris-HCl（pH8.0）、10mMEDTA。加入溶液Ⅰ后溶液變渾濁，可劇烈振蕩，使菌體沉淀轉(zhuǎn)變成均勻的菌懸液，此時(shí)細(xì)胞尚未破裂，染色體不會(huì)斷裂。葡萄糖能使菌液密度增加，使大腸桿菌重懸并使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部。因此，沉淀菌體的量適宜即可，如果菌體過(guò)多，可能會(huì)導(dǎo)致溶液Ⅰ無(wú)法混勻，細(xì)胞裂解不充分。加入溶液Ⅰ重懸要充分，如果細(xì)胞沒(méi)有完全散開懸浮，將會(huì)影響溶液Ⅱ裂解細(xì)胞，最終導(dǎo)致提取產(chǎn)物中含較多的蛋白質(zhì)，染色體DNA等雜質(zhì)。另外葡萄糖可以維持細(xì)胞滲透壓，防止細(xì)胞提前破裂。葡萄糖還可以防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。EDTA具有螯合Ca2+和Mg2+的作用，而Ca2+和Mg2+是DNase的輔助因子，因此EDTA可避免DNase對(duì)DNA的降解作用。Tris-HCl可以提供適當(dāng)?shù)膒H。溶液Ⅰ在離心后要盡可能去除干凈溶液Ⅱ含有0.2MNaOH、1%SDS。溶液Ⅱ使用前用10M的NaOH和10%的SDS母液配制，配制時(shí)要防止NaOH吸收空氣中的H2O和CO2而減弱了堿性。加入溶液Ⅱ時(shí)，菌液變黏稠、透明，無(wú)菌塊殘留。NaOH可以使細(xì)胞溶解。同時(shí)，強(qiáng)堿性使染色體DNA、質(zhì)粒DNA和蛋白質(zhì)變性；SDS在加入溶液Ⅲ后起到使蛋白質(zhì)變性的作用。加入溶液Ⅱ時(shí)搖勻一定要輕柔，劇烈會(huì)導(dǎo)致基因組DNA斷裂；靜置時(shí)間也不能過(guò)長(zhǎng)，因?yàn)榛蚪MDNA在堿性條件下會(huì)慢慢斷裂。溶液Ⅲ含有5MKAc60mL、冰醋酸11.5mL、重蒸水28.5mL，溶液終濃度為：K3M，Ac5M。加入溶液Ⅲ時(shí)，會(huì)立即出現(xiàn)白色沉淀。溶液Ⅱ中的SDS遇到KAc后變成了十二烷基硫酸鉀（PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。SDS和蛋白質(zhì)結(jié)合，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，此外大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。HAc起到中和NaOH的作用，因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的堿性條件下會(huì)打斷基因組DNA，基因組DNA被打斷就無(wú)法被PDS共沉淀。同時(shí)加HAc可以使變性的質(zhì)粒DNA復(fù)性。該步反應(yīng)形成的高鹽環(huán)境進(jìn)一步加速了這一沉淀。冰浴使反應(yīng)更充分。加入溶液Ⅱ和溶液Ⅲ后，應(yīng)緩慢上下顛倒離心管數(shù)次，切忌在渦旋振蕩器上劇烈振蕩，否則，染色體DNA會(huì)斷裂成小片段，不形成沉淀，而溶解在溶液中，與質(zhì)粒DNA混合在一起，不利于質(zhì)粒DNA提純。因此，操作時(shí)一定要緩慢柔和，采用上下顛倒的方法，既要使試劑與染色體DNA充分利用，又不破壞染色體的結(jié)構(gòu)。之后的實(shí)驗(yàn)操作是將菌液在4℃離心機(jī)中12000rpm離心15min，小心轉(zhuǎn)移上清到新的離心管內(nèi)。上清液中含有大量RNA、斷裂的DNA片段和質(zhì)粒DNA。注意此時(shí)沉淀不實(shí)，寧愿少吸上清，也不要帶入沉淀，因?yàn)閹氲某恋碓谥蟛僮髦袩o(wú)法去除。在使用離心機(jī)時(shí)，樣品放置要對(duì)稱平衡，否則會(huì)嚴(yán)重?fù)p害離心機(jī)的使用壽命。沉淀DNA通常使用預(yù)冷無(wú)水乙醇，在低溫條件下長(zhǎng)時(shí)間放置可使DNA沉淀完全。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀。TE溶液是pH緩沖液，含有10mMTris-HCl（pH8.0）、1mMEDTA，呈弱堿性，有利于保護(hù)堿基對(duì)，為DNA提供穩(wěn)定的生理狀態(tài)。同時(shí)TE溶液含有EDTA，EDTA可抑制DNA酶的作用。RNaseA是一種廣泛應(yīng)用的核糖核酸內(nèi)切酶，專一性催化C-U間3’-5’磷酸二酯鍵的裂開形成具有2’,3’-環(huán)磷酸衍生物寡聚核苷酸，可以去除殘留的RNA。寡聚核糖核苷酸會(huì)保存在質(zhì)粒DNA溶液中，但不影響后續(xù)的常規(guī)操作。質(zhì)粒DNA中蛋白質(zhì)的去除通常采用酚、氯仿抽提。質(zhì)粒DNA純化過(guò)程中使用酚/氯仿/異戊醇混合液。苯酚是強(qiáng)的蛋白阻斷劑，可使蛋白變性析出。同時(shí)，Tris飽和酚的pH在8.0左右，此時(shí)DNA分布于水相而RNA分布于有機(jī)相，從而可分離上清獲得DNA。pH為8.0的Tris飽和酚比重略大于水，且與水有很大的互溶性，即酚可以進(jìn)入水相從而影響后續(xù)的酶反應(yīng)。因此，需要使用氯仿。氯仿也是蛋白阻斷劑，但強(qiáng)度弱于苯酚，其主要作用是將同水以極小比例互溶的苯酚萃取出來(lái)。如果不加氯仿，殘留的苯酚會(huì)阻礙酶切反應(yīng)等，且不利于獲得含質(zhì)粒的水相。加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收。異戊醇則可起消除抽提過(guò)程中出現(xiàn)的泡沫，使水相和有機(jī)相間的界面更清晰，從而便于回收質(zhì)粒DNA。采用酚/氯仿去除蛋白質(zhì)效果較單獨(dú)用酚或氯仿好，但需要抽提多次。質(zhì)粒DNA溶解子在上層的水相中。在實(shí)驗(yàn)的時(shí)候要注意，酚有強(qiáng)烈的腐蝕性，能損傷皮膚和衣物，使用時(shí)應(yīng)小心并且戴手套操作。皮膚如不小心沾到酚，應(yīng)立即用堿性溶液、肥皂或大量清水沖洗。應(yīng)避免瓊脂糖溶液在微波爐里加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，否則溶液將